197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 A találmány tárgya eljárás új expressziós vektorok előállítására, amelyek az Escherichia coli (továbbiakban: E.coli) riboszomális RNS operon (rrn operon) P2 promoteréből és az E.coli lac operon szabályozó szekvenciáiból kialakított, új típusú promoted tartalmaznak. Ismeretes, hogy az in vitro DNS rekombináció módszereivel tetszőleges eredetű és információtartalmú gének juttathatók be baktériumsejtekbe. Az, hogy az idegen DNS stabilan fennmaradjon a sejtben, és a benne kódolt információ kifejeződjék, megfelelő hordozó molekulákkal: expressziós (kifejező) vektorokkal biztosítható. Egy fehérjét kódoló gén baktérium sejtben történő expressziójakor (kifejezésekor) a baktérium sejt enzimei előbb a transzkripció során a DNS-ről mRNS-t szintetizálnak, majd erről a transzlációban polípeptidet. Az expressziót egy úgynevezett promoter tartomány iniciálja. Az RNS polimer áz ezt a promoted ismeri fel, és ehhez kötődik a transzkripció iniciálását megelőzően. A gyakorlatban az in vitro DNS rekombináció módszere akkor alkalmazható gazdaságosan, ha a célzott fehérje kielégítő mennyiségben keletkezik, azaz ha mind a transzkripció, mind a transzláció megfelelő intenzitású. A promoterekkel szemben tehát — egyéb szükséges tulajdonságok mellett — alapkövetelmény, hogy „erősek“ legyenek, azaz megfelelő intenzitású transzkripciót biztosítsanak. Expressziós vektorokat már igen sokféle promoter felhasználásával készítettek. Ilyenek például a lac, trp bla, 11 p, lambda pr. promoterek. Ezek közül a gyakorlatban is elterjedten használják a lac (laktóz ) operon promotert — elsősorban jól kontrollálható működése miatt — annak ellenére, hogy viszonylag gyengébb promoter. Különböző eredetű ún. hibrid-promotereket tartalmazó expressziós vektorokat ismertet például a 0 067 540 számon közrebocsátott, 82302532.5 számú európai szabadalmi bejelentés. Ezeket az jellemzi, hogy a promoter működés "szempontjából fontos -35 és -10 nukleotidok körüli régiók az egyik, illetve a másik promoterből származnak, azaz -— másszóval — a két, különböző eredetű promoter rész összekapcsolása a -35 és a -10 régiók közötti tartományban történik. Az említett találmányi bejelentés szerint az ilyen promoterek felhasználásával készült expressziós vektorok ipari célokra kiválóan alkalmazhatók, mert működésük jól kontrollálható és ugyanakkor jó intenzitású transzkripciót biztosítanak. Hasonló hibrid-promotert ismertet a Boros et.al.: Expression based on the rac fusion promoter (Gene, 42 ( 1986)97—100) cikk is. Célunk az volt, hogy a korábbiaknál erősebb, tehát jó fehérje hozamot biztosító, ugyanakkor jól szabályozható promoter tartományt tartalmazó, expressziós vektorokat készítsünk. Kutatómunkánk során meglepő módon azt találtuk, hogy a korábbiaknál előnyösebb, 2 1 igen jól szabályozható és kitűnő génexpressziót biztosító promoterek állíthatók elő oly módon, hogy egy E.coli riboszomális RNS operon (rrn operon) P2 promoterét és az E.coli lac operon szabályozó szekvenciáit a -35 és a -10 körüli régiókon kívül) downstream irányban (a gén átírásának irányában) kapcsoljuk össze; azaz, ha a riboszomális RNS operon P2 promoterének a -10-es régión kívüli, downstream irányban lévő, GC bázisban gazdag régióját helyettesítjük egy analóg lac Operon darabbal. Ezek a promoterek, annak ellenére, hogy két promoter kombinációjával készültek, nem hibrid promoterek, hiszen a promoter működés szempontjából fontos -35 és -10 régiók egyaránt az rrnB operon P2 promoteréből származnak. Továbbá meglepő módon azt találtuk, hogy ha a fenti promoter rendszert tartalmazó vektorokban közvetlenül a -10 régió után, downstream irányban eltávolítjuk a következő 4 bázist: TGCA, a transzkripció intenzitása még megduplázódik. Utóbbi felismerésünk különösen figyelemre méltó, mert egyrészt a szakirodalomban semmiféle utalás nem található arra vonatkozóan, hogy a jelzett 4 bázis a promoter működés szempontjából bármilyen szerepet játszana, másrészt a transzkripció intenzitásának megduplázódása igen jelentős eredmény olyan promoterek esetében, amelyek már eleve igen erős promoternek számítanak. A fentiek a'apján találmányunk tehát eljárás, az E.coli riboszomális RNS operon (rrn operon) P2 promoteréből és az E.coli lac operon szabályozó szekvenciáiból kialakított rekombináns promotert tartalmazó expressziós vektorok előállítására, mely promoterben az rrn és a lac eredetű szakaszok a -35 és a -10 régiókon kívül, downstream irányban vannak összekapcsolva, s amelyekben közvetlenül a -10 régió után adott esetben hiányzik a TGCA szakasz. Találmányunk kiterjed továbbá a találmányunk szerinti expressziós vektorokkal transzformált E.coli sejtek előállítására, valamint az ezen transzformált E.coli sejtekkel történő fehérjetermelő eljárásra is. Az újtípusú promotereket tartalmazó expressziós vektorokat a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy egy alkalmas hordozó vektorba épített E.coli riboszomális RNS operonjábó! (rrn operon) a struktúrgének jelentős részét eltávolítjuk és a P2 promotert tartalmazó rrn operon részletet a -35 és -10 régiókon kívül, downstream irányban lac operon elejével kapcsoljuk össze oly módon, hogy az rrn lac eredetű szekvenciák kapcsolódási helyén Nsil hasító hely jöjjön- létre, majd T4 polimeráz alkalmazásával eltávolítjuk a TGCA szakaszt, végül a fenti eljárások bármelyike szerint kialakított szabályozó részek közé beépítjük a kifejezni kívánt struktúrgént. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
