197595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás expressziós vektorok előállítására
197595 A találmány szerinti expressziós vektorok és az ezekkel biztosított génexpresszió főbb jellegzetességei az alábbiakban foglalhatók össze: 1. E vektorok szerkezeti részét alkotó új típusú promoterek (jelük: 6/23, illetve 6/23 [-Nsi] ) a sejt fiziológiás állapotától függetlenül.’egyenletesen igen magas szintű transzkripciót biztosítanak, ami — a sejt de novo RNS szintézisének több, mint 90%-át jelenti, és — ezzel összhangban a sejt összes fehérjéinek 30—80%-át eléri az idegen géntermék felhalmozása, 2. A transzkripció az rrn operon kettős terminátor régióján terminál. 3. A transzkripció eredménye hibrid RNS, ami a beépített idegen génen kívül rRNS eredetű részeket is tartalmaz, így a mRNS stabilitása megnövekedett, s féléletideje nagyobb az átlagosnál. 4. A transzkripció intenzitása a lac operátoron keresztül szabályozható. 5. A találmány szerinti új vektorcsalád egyes tagjaiban az idegen gén terméke fúziós-fehérjeként szintetizálódik. Ez egyrészt nagyobb stabilitást biztosít a fehérjének, másrészt könnyen detektálható és mérhető a fúziós partner (béta-galaktozidáz-alfa peptid), s így a génkiíejeződés egyszerűen követhető. Ugyanezen vektoroknál (plazmidoknál) az idegen gén a lacZ’ után nem fúziós formában is beépíthető, ekkor a konstrukció egy bakteriális operonként működik, és az idegen gén önálló fehérjeként szintetizálódik. A beépített gén ekkor E.coli riboszomakötőhelyet kell hogy tartalmazzon. A plazmid család más tagjainál az idegen gén rögtön a transzlációs start helyre építhető be a riboszóma kötőhely utáni optimális pozícióban, vagy úgy, hogy a gén saját ATG-je biztosítja a transzláció iniciációját, vagy ennek hiányában a génhez kapcsolt Clal linker ATG szekvenciája látja el ezt a feladatot. Ezekben a vektorokban (plazmidokban) saját riboszóma kötőhellyel rendelkező idegen gén további hasítóhelyekre is beépíthető. 6 7 8 6. A találmány szerinti vektorokban működő új típusú promoter kialakítása során a riboszomális promoter downstream szabályozó régióját eltávolítottuk. így a riboszómális promoterre jellemző — a fiziológiás körülményekre igen precízen reagáló — szabályozás megszűnt, és a promoter a körülményektől függetlenül, az elérhető maximális intenzitással működik. 7. A transzkripció a riboszomális operonon egy citozin bázison iniciálódik, ezt adeninre vagy guaninra változtatva az elérhető transzkripciós aktivitás jelentősen növekszik. 8. A promoterhez a lac operon szabályozó régióit kapcsoltuk. E szerkezeti kialakítás az elérhető maximális transzkripciós intenzitást indukált körülmények között nem befolyásolja, de lehetővé teszi, hogy a lac operonnal 3 analóg módon szabályozzuk a promoter működését; továbbá meggátolja, hogy az állandó igen aktív transzkripció és transzláció hátrányosan befolyásolja a sejt anyagcseréjét. 9. A találmány szerinti expressziós vektorok előnyös kiviteli alakjait, továbbá az jellemzi, hogy méretük 2800—4500 bázispár; ampicillin rezisztenciát biztosító gént tartalmaznak ; a transzkripciós és transzlációs szignálok egymáshoz viszonyított helyzete optimalizált; teljes nukleotid szekvenciájuk ismeretes; replikációjuk Col El típusú; sejtenkénti kópiaszámuk 20—30 (de egyes esetekben a T/35280 közzétételi számú magyar szabadalmi bejelentés szerinti nagy kópiaszámú változatukat is elkészítettük); a kifejezni kívánt idegen gén beépítésére több, különböző hasítási helyet tartalmaznak, és ezekbe a gén mindhárom leolvasási fázisba beépíthető. A találmány szemléltetésére bemutatott új expressziós vektorok például az alábbi restrikciós endonukleáz hasítási helyeket tartalmazzák: PvuII, Hindii!, Clal, EcoRI, BamHI, Bglll, Xbal, PstI, Hpal. A fenti expressziós vektorok felépítésére kidolgozott találmány szerinti eljárás előnyösen az alábbi — későbbiekben részletezendő — lépéseket foglalja magába: 1. Az E.coli rrnB operonjának klónozása pBR322 vektorban. 2. Az operon promotereinek klónozása stabilan plazmidokban, a strukturális gén nagyrészének eltávolításával; a transzkripciós start (promoter) és stop (terminátor) régiók egymáshoz közel helyezése. 3. Az E.coli lac operon elejének összeépítése a lerövidített rrnB operonnal. 4. 6/23 promoter és a megfelelő szabályozó régiók kialakítása. A promoter átalakítása adott esetben 6/23 [-Nsi] promoterré. 5. Az idegen gén beépítését lehetővé tevő restrikciós hasítási helyek kialakítása a plazmid megfelelő részén. Különböző egyedi expressziós vektor konstrukciós kialakítása. Találmányunk további részleteit a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákban ismertetettekre korlátoznánk. 1. példa A találmány szerinti új expressziós vektorcsalád előállítása 1. Az E.coli rrnB riboszomális RNS operon izolálásához kiindulási anyagként szolgálhat az E.coli teljes DNS készlete, vagy olyan transzdukáló bakteriofágok DNS-e, amelyek hordozzák az operont. Az rrnB operon izolálása a X.rifd 18 transzdukáló bakteriofág DNS- ből Kiss A. és mtsai. [1978, Gene 4, 137—152], az E.coli kromoszómából pedig Boros I. és mtsai. [1979, Nucl. Acids Res. 6, 1817—1830] módszerével történhet. A találmányban leírt expressziós vektorok kialakításának első lépése a pBB9 jelzésű plazmid (MNG 00300) létrehozása volt (1. ábra). Ebben a pBR322 (MNG 00298) vektor plazmid [Sutcliffe, J. G., 4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
