197584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,3-diamino-2,3-didezoxi-hexóz származékok és hatóanyagként ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197584 ben oldva szubkután beadagolunk. A vizsgált vegyületeket 0,3 ml fiziológiás sóoldatban feloldjuk és a harmadik napon az állatoknak parenterálisan beadagoljuk. Ha a vizsgálandó vegyület sóoldatban nem oldódik, akkor orálisan adagoljuk be. A negyedik napon az állatokat megfertőzzük, 0,2 ml (sejt-szám/egér például Pseud.aeruginosa A12; 1 x IO5, E.coli A120; 2 x 106) oltóanyaggal. A fertőzést követő tíz napon át az állatokat megfigyeljük és a halál/nap vizsgálati értéket feljegyezzük. A kontroll és standard vizsgálatok összevetéséből a következő paramétereket határozzuk meg: a) átlagos túlélési periódus b) túlélési arány. A vizsgált találmány szerinti eljárással előállított vegyületek a kezeletlen kontrolihoz viszonyítva, mind a Pseudomonas, mind az E.coli fertőzésekkel szemben az a és b vizsgált paraméterek jelentős javulását okozták. 2. Baktériumpusztulás megnövekedésének in vitro meghatározása polimorf magvú leukocitákkal A vizsgálattal azt állapítjuk meg, hogy mely a találmány szerinti eljárással előállított anyagok növelik a neutrofil-leukociták belső mikrobaölő hatását. Neutrofil forrásként, előzőleg 4 órán át 5%-os kazeinnel tioglikoláttal vagy 0,1%-os glikogénnel kezelt egerek hashártya váladékát alkalmazzuk. A vizsgálandó anyagokat Hanks-féle sóoldatban feloldjuk. A vízben nem oldódó anyagokat kismennyiségű dimetil-szulfoxidban oldjuk fel, majd a Hanks-féle oldattal a kívánt térfogatig hígítjuk. A vizsgálandó anyagot, neutrofileket és 10% homológ vérsavóval opsonifikált baktériumot tartalmazó oltóelegyet 2 órán át, 37°C hőmérsékleten rázatjuk, majd a túlélő baktériumokat sejt-szám alapján meghatározzuk. A vizsgált anyagok jelenlétének a hatását a leukociták sejtölő hatására t-vizsgálattal határozzuk meg. Kontrollként vizsgálati anyag jelenlétében opsonifikált baktériumot használunk. 3. Vizsgálati anyagokkal kezelt egerekből származó neutrofilek baktériumölő hatása A vizsgálattal in vitro azt állapítjuk meg, hogy vizsgálati anyagokkal kezelt állatokból származó neutrofilek baktériumölő kapacitása hogyan növekszik meg. Négy állatból álló állatcsoport minden egyes tagját szubkután vagy intraperitoneálisan a vizsgálandó vegyülettel kezelünk. 24 óra eltelte után a peritonealis neutrofil leukocitákat 5%-os kazeinnel, tioglikoláttal vagy 0,1 % glikogénnel végzett előkezelés után kimossuk. Az oltóelegyet, ami a kezelt (vagy kezeletlen) állatokból származó neutrofil leukocitákat és a 10% homológ vérsavóval opsonifikált baktériumot tartalmazza, 2 órán keresztül, 37°C hőmérsékleten rázatjuk, majd a túlélő baktériumokat sejtszámlálással meghatározzuk. 3 A találmány szerinti eljárással előállított anyagokkal kezelt és kezeletlen állatokból származó leukociták baktériumölő hatását t-vizsgálattal hasonlítjuk össze. 4. A vizsgálati anyagok endotoxin hatásának meghatározása Limulusamebocit vizsgálatában Az endotoxin katalizálja a limulusamebocitelizát gélesedésében egy proenzim aktivi- 4ását. Egy színezékképző vizsgálati anyagból a p-nitroanilin elválasztását mérjük. Az elválasztás mértékét fotometrikus úton határozzuk meg, mivel az abszorpció és az endotoxin koncentrációja (vagy aktivitása) a 0,01—0,1 pm/ml intervallumban lineáris összefüggést mutat (összevetve a standard endotoxin abszorpciós értékeivel). Minden egyes mintából 1:10 hígítási sort készítünk (kétszer desztillált, pirogénmentes vízzel) és minden sort kontroll mintával is összehasonlítunk. 100 pl mintát vagy standard-mintát vagy kontroli-mintát 100 pl limulusamebocit lizáttal kezelünk. A reakciót 10 perc elteltével 200 pl 50%-os ecetsavval leállítjuk. A mintákat összerázzuk, majd abszorpciójukat 405 nm-en spektrofortométerben meghatározzuk. Kontroll értékként a desztillált víz abszorpcióját használjuk. A minták endotoxin tartalmát (endotoxin aktivitását) endotoxin egységekben (E.U.) standard endotoxin értékeket használva lineáris regreszsziószámítással határozzuk meg. 5. Endotoxin sokk előidézése egerekben A vizsgálattal endotoxin sokkot idézünk elő vagy klinikailag hasonló állapotot ahhoz, amit galaktózaminnal (GalN) érzékenyített egerekben halált okozó LPS-típusú anyagok okoznak. Hat fős csoportokban lévő, nőnemű C 57 bl. típusú egereknek intraperitoneálisan 0,5 ml PBS-ben oldva 8 mg GalN-t és 0,2 ml fiziológiás sóoldatban oldva, salmonelle abortus equi-ból (Sigma) származó 0,1 pg LPS-t adagolunk be. Ez a kezelés a C. Galanos és társai által a Proc. Natl. Acad. Sei., USA 76 (1979) 5939—5943 publikált cikk szerint 5—9 óra alatt az összes vizsgálati állat elpusztulását okozza. A standard vizsgálati eljárásban alkalmazott LPS helyett a vizsgálati anyagokat különböző dózisokban parenterálisan vagy orálisan, akár a GalN beadagolásával egyidejűleg, akár több adagban azt megelőzően vagy követően, adagoljuk be. Spearman-Karber módszer szerint az LD50-t számítjuk, vagy meghatározzuk azt a legkisebb dózist, ami az összes állat elpusztulásához vezetett. 6. LPS (endotoxin)-tolerancia előidézése A vizsgálati egereknek naponta parenterálisan LPS-t adagolva elérhetjük, hogy az állatokban úgynevezett tolerancia alakuljon ki, ami megvédi őket az ellen, hogy a GalN beadagolását követően az LPS pusztulásukat okozza (lásd 5. vizsgálat). Az (I) általános képletű vegyületeket három napon át intraperitoneálisan 0,25 mg/nap/állat dózisban beadagolva olyan toleranciát értünk el, hogy az 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
