197565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált indolok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
197565 ben kb. 0,1—25 mg/kg/nap határok között lehet. A tromboxán-szintetáz enzim in vitro gátlását Sun módszerével analóg eljárással [lásd: Sun, Biochem. Biophys. Res. Comm. 74 1432 (1977)] lehet kimutatni. A kísérleii eljárást az alábbiakban ismertetjük: l4C-arachidonsavat inkubáltunk egy olyan enzimrendszerrel, amely egyrészt juhok ondóhólyagjából nyert prosztaglandin-ciklooxigenázt tartalmazott szolubilizált és részlegesen tisztított állapotban, másrészt egy roncsolt emberi vérlemezkékből származó nyers mikroszomális tromboxán-szintetáz preparátumot tartalmazott. Az inkubációs közeghez hozzáadtuk a vizsgálandó vegyületet valamilyen pufferben, vagy szükséges esetben kevés etanolban oldva. Az inkubációs periódus (30 perc) végén a prosztaglandin E2-t (PGE2) nátrium-bór-hidriddel redukáltuk és így prosztaglandin F2a és F2ß (PGF2a+ß) elegyet kaptunk. A radioaktív termékeket és a szubsztrátum feleslegét extrakcióval etil-acetátos oldatba vittük, majd a kivonatot szárazra pároltuk. A maradékot acetonban oldottuk, az oldatot vékonyréteg-kromatográfiás lemezre vittük fel és toluol-aceton-jégecet térfogat szerint 100:100:3 arányú elegyéből álló oldószerrendszerrel kromatografáltuk. Ezután megállapítottuk a tromboxán B2-nek (TxB2) és a PGF2a+ß-nak megfelelő radioaktív zónák helyét, majd ezeket folyadékszcintillációs edénykékbe vittük és számlálással radioaktivitást mértünk. A számlálással kapott TxB2/PGF2a+ß arányt a vizsgált vegyület minden egyes koncentrációjára nézve kiszámítottuk és az IC50-értéket (a vizsgált vegyület azon koncentrációja, melynél a TxB2/ /PGF2a-(-ß arány a kontrollérték 50%-ára csökken) grafikusan meghatároztuk. A prosztaglandin-ciklooxigenázra in vitro gyakorolt hatást a Takeguchi és szerzőtársai által a Biochemistry 10, 2372 (1971) irodalmi helyen leírt módszer módosított változatával mértük; a kísérleti eljárást az alábbiakban ismertetjük: Prosztaglandint szintetizáló enzimkészítmény gyanánt juhok ondóhólyagjából származó liofilizált mikroszómákat használtunk és mértük a uC-arachidonsav PGE2-vé történő konverzióját. A vizsgálandó vegyületet valamilyen pufferben, vagy szükséges esetben kevés etanolban oldva hozzáadtuk az inkubációs elegyhez. A prosztaglandinokat ezután extraháltuk és vékonyréteg-kromatográfiával szétválasztottuk. A lemezeket radioaktivitásra nézve letapogattuk, majd a PGE2- -nek megfelelő radioaktív zónákat folyadékszcintillációs edénykékbe vittük át és számlálással radioaktivitást mértünk. A gátlásra vonatkozó IC50-értékeket grafikusan határoztuk meg, ez a vizsgált vegyület azon koncentrációja, amely a szintetizált PGE2 menynyiségének 50%-os csökkenését okozza. 3 A prosztaciklin (PGl2)-szintetázra in vitro gyakorolt hatást a Sun és szerzőtársai által leírt módszerrel [Sun et al., Prostaglandins 14, 1055 ( 1977) I analóg módon mértük; az eljárást az alábbiakban ismertetjük: l4C-arachidonsavat inkubáltunk egy olyan enzimrendszerrel, amely egyrészt juhok ondóhólyagjából nyert prosztaglandin-cildooxigenázt tartalmazott szolubilizált és részlegesen tisztított állapotban, másrészt szarvasmarha-aorta mikroszomális frakciója formájában nyers PGI2-szintetázt tartalmazott. A vizsgálandó vegyületet ezután valamilyen pufferben, vagy szükséges esetben kevés etanolban oldva hozzáadtuk az inkubációs közeghez. A reakcióelegyet ezt követően 100 millimól trisz-HCI-pufferben ( pH = = 7,5) 30 percig 37°C-on inkubáltuk, majd pH = 3 értékűre megsavanyítottuk és etil-acetáttal extraháltuk. A kivonatot szárazra pároltuk és a maradékot acetonban oldottuk. Az oldatot vékonyréteg-kromatográfiás lemezre vittük fel és a Sun és szerzőtársai által leírt oldószerrendszerrel kromatografáltuk. A radioaktív zónák helyét megfelelő detektorral végzett letapogatással megállapítottuk. Ezután a 6-keto-PGF,a-ának (a prosztaciklin-biotranszformáció stabil végterméke) és a PGE2-nek megfelelő radioaktív zónákat folyadékszcintillációs üvegcsékbe helyeztük el és számlálással radioaktivitást mértünk. A számlálás útján kapott 6-keto-PGF,a/PGE2 arányt a vizsgált vegyület valamennyi koncentrációjára nézve kiszámítottuk. A gátlásra vonatkozó IC50-értékeket (ami alatt a vizsgált vegyület azon koncentrációját értjük, amelynél a 6-keto-PGF,a/PGE2 arány a kontrolihoz viszonyítva 50%-al csökken) végül grafikusan határoztuk meg. A tromboxán szintézisének gátlását és a tromboxán plazmaszintjének csökkenését in vivo patkányokon határoztuk meg az alábbiakban ismertetett módon [a módszer a Tai és szerzőtársai által az Anal. Biochem. 87, 343 (1978) és a Salmon által a Prostaglandins 15., 383 (1978) irodalmi helyeken leírtak adaptálása] : Patkányoknak vagy csak vivőanyagot, vagy a vizsgálandó vegyületet adtuk be; a beadás után 2 órával az állatok 0,5 mg/kg dózisban „ionophore A 23187"-et kaptak intravénás injekció formájában. Az ionofor-injekció után 2 perccel vizsgálati célokra vérmintákat vettünk le. Mindegyik plazmamintából egy alikvot részt tromboxán B2-re, egy másik alikvot részt G-keto-PGF^-ra [ezek a tromboxán A2, illetve a prosztaciklin (PGI2) stabil metabolitjai] nézve radioimmunoassay módszerrel vizsgáltuk. Az (I) általános képletű vegyületek nagyon hatásos és szelektív tromboxán-szintetáz inhibitorok. A tromboxán-szintetáz gátlása tekintetében már hatásos szint sem a hasznos prosztaciklin-szintetáz enzimrendszert, sem a prosztaglandin-ciklooxigenáz enzimrendszert szignifikánsan nem gátol -4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
