197359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bacitracin előállítására módosított Bacillus törzsek fermentálása útján
4 197359 1. táblázat 5 Tulajdonság Törzs MNG 00110 Phylaxia termelő törzs MNG 101012 ATCC 9800 MNG 101013 NCTC 6816 bacitracin termelés jól termelő rossz termelő nem termel virulens fágok elleni rezisztencia érzékeny rezisztens rezisztens antibiotikum elleni rezisztencia oxitetraciklin rezisztens érzékeny rezisztens eritromicin rezisztens érzékeny rezisztens bacitracin rezisztens érzékeny rezisztens Mutánsok előállítása N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel Az MNG 00110 Bacillus törzset az alábbi 25 összetételű tápközegben egy szaporítottuk: éjszakán át élesztökivonat 5 g tripton 10 g NaCl 5 g MgS04 IO'4 M CaClí 5xl0-5 M viz (az alábbiakban: YT tápoldat) 1 liter A baktérium szuszpenziót 50-szeresére 35 hígítottuk és 2 órán át tovább szaporítottuk. Utána a sejteket centrifugáltuk, majd 6,0 pH értékű 1/15 mólos foszfátpufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz milliliterenként 20 jug N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guariidint 40 adtunk, és az elegyet 1 órán át állni hagytuk. A sejteket centrifugáltuk, pufferrel mostuk, újra centrifugáltuk, majd a fenti tápközegben szuszpendáltuk. A kezelt sejteket 30 °C-on 2 órán át folytatott levegőzte- <15 tés után szélesztettük (a módszer leírását lásd: Sherrat és Collins, J. Gen. Microbiol. 76, 217-230, 1973). A szélesztés után olyan törzset izoláltunk, amely 20%-kal több bacitracint termel, 50 mint a szülő törzs. Az izolált törzs jele PP-188. Ultraibolya sugárzással 55 A PP-188, sz. törzs spóraszuszpenzióját kétszer mostuk steril desztillált vízzel, majd 30 W-os Philips Germicid lámpával 30 cm távolságból 1,5 percen át besugároztuk, utána 60 YTA-táptalajra szélesztettük. (Az YTA táptalaj összetétele az YT tápoldatéval azonos, de 1,8% agart is tartalmaz.) Az UV-kezelés eredményeként ornitin//arginin hiánymutáns törzseket izoláltunk, 65 4 nevezetesen az AH 22 jelű törzset, amelyet NCAIM B(P) 00343 szám alatt a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél letétbe helyeztünk. A törzs 50 pg//rnl ornitint tartalmazó minimál táptalajon jól, 50 pg/ml arginint tartalmazó minimál táptalajon rosszul nő, és a szülői törzsnél 25%-kal több antibiotikumot termel. Arzénét rezisztens mutánsok izolálása A PP-188. sz. törzs sejtjeit fiziológiás konyhasó-oldattal mostuk, és a foszfátsók helyett 200 mmól arzenátot tartalmazó Spizizen minimál tápoldatban szuszpendáltuk, majd egy éjszakán át 30 °C-on levegőztettük. A túlélő sejteket centrifugáltuk, YT tápoldattal mostuk, és szélesztettük [a módszer leírását lásd: Alfesi, Friedberg és Friedberg, J. Bacteriol. 137(1), 69-72, 1979). A PP-188 törzs 25 db arzenát rezisztens származéka közül 5 db 10%-kal, 2 db 25%-kal és 2 db 50%-kal több bacitracint termelt. A legjobb termelő jele AS 19 és a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél NCAIM B(P) 00344 szám alatt van letétben. Ez a törzs az optimális mennyiségű bacitracin termeléshez foszfátkiegészítést igényel, míg a többi nem. Protoplasztf uzió A protoplaszt készítés, a fúzió és a regeneráltatás Gábor és Hotchkiss [J. Bacteriol. 137(3), 1316-1353, 1979] szerint történik. A fúzióhoz használt szülői törzsek közül az egyik fágreziszlens és antibiotikumérzékeny, a másik fágérzókeny és antibiotikumrezisztens volt. A PP-188 törzset egyrészt az MNG 101 012, másrészt az MNG 101 013 törzzsel fuzionáltuk.
