197359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bacitracin előállítására módosított Bacillus törzsek fermentálása útján
6 197359 7 Protoplasztok előállítása céljából az exponenciális fázisú sejteket mostuk az alábbi összetételű oldattal: CaCl2 0.1 mM MgCk 0.15 mM K2SO4 0.05 mM zselatin 1 g szacharóz 68.5 g 0.05 mólos Tris-HCl puffer ad 1 liter (pH 7,4) (az alábbiakban BP-oldat), majd milliliterenként 0,1 mg lizozimot tartalmazó BP-oldatban felvettük és 37 °C-on 45 percig inkubáltuk. A képződött protoplasztokat BP-oldattal kétszer mostuk, és a fuzionálandó protoplasztokból egyenlő térfogatokat elegyítettünk. A protoplaszt keverékből 0,2 ml-t 1,8 ml PEG-oldattal óvatosan elkevertünk (PEG-oldat: 4 g polietilén-glikol 4000 6 ml PB-oldatban). Az elegyet 1 percig állni hagytuk, majd BP-oldattal hígítva 68,5 g/1 szacharózzal kiegészített YTA-agaron szélesztve regeneráltattuk. A regeneráltatás után a rekombinánsokat virulens fág és antibiotikum jelenlétében szelektáltuk, hogy a szülői típusokat kiküszöböljük, az alábbiak szerint. A PP-188 és a 101 013 fúziója és regeneráltatása után a kinőtt telepeket lekapartuk, milliliterenként 108 virulens fágot tartalmazó YT tápoldatban szuszpendáltuk és 37 °C-on 16 órán át rázattuk, igy a fágérzékeny sejtek jelentős része elpusztult. A túlélő sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és - virulens fágok inaktiválása céljából - fág antiszérummal kezeltük, majd YTA táptalajon szélesztettük. A kinőtt telepeket YTA táptalajra, illetve mintegy 10® sejt/cm3 mennyiségben Micrococcus flavus ATCC 10 240-et tartalmazó YTA táptalajra vittük fogpiszkálóval. A lemezeket 37 °C-on 16 órán át inkubáltuk, és a Micrococcus flavus-os lemezen gátlási gyűrűt adó telepeket bacitracintermelésre és fágrezisztenciára vizsgáltuk. Ilyen módon jól termelő, fágrezisztens fuzionált rekombináns törzseket kaptunk, amelyek közül a legjobb a PP-188 törzs hozamának mintegy 80%-át termelte virulens fág jelenlétében is, jele HS-124. A PP-188 és a 101 012 fúziója és regeneráltatás után az eljárás csak annyiban módosult az előzőekben bemutatotthoz képest, hogy az YT tápoldat virulens fágot és 20 E//ml bacitracint tartalmazott, igy mindkét szülői típust elimináltuk a rekombinánsok mellől. Az így kapott számtalan jól termelő és fágrezisztens törzs közül a legjobb virulens fág jelenlétében is termelt annyit, mint u P- 188, fág nélkül 50%-kal több; jele HS-13. A fentiekben leirt törzsek előállítását vázlatosan a mellékelt ábra mutatja. A találmányt az alábbi kiviteli példákkal részletesen ismertetjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. példa A különböző törzsek termelő képessége 1. Oltóanyag előállítása (általános előírás) A Bacillus licheniformis törzset YTA táptalajra oltottuk és 37 °C-on 120 órán át inkubáltuk. A spóráztatott tenyészetet +4 °C-on tároltuk. A ferde agaron fenntartott tenyészetből kacsnyi mennyiséggel 100 ml YT tápoldatot oltottunk és 120 órán át rázattuk, így a tenyészet 80%-ban spórás. A spóraszuszpenziót 2 ml-enként sterildugós kémcsövekbe adagoltuk, és felhasználásig +4 °C hőmérsékleten tároltuk. A 2 ml spóraszuszpenzióval 100 ml YT tápoldatot oldottunk és 30 °C-on 16 órán át rázattuk. A továbbiakban ezt használtuk oltóanyagként. 2. Termelő tenyészet 10% oltóanyagot 50 ml BTK tápoldathoz adtunk, amelynek összetétele (vegyes %-ban) az alábbi: extrahált szójaliszt 6.0 v% kukoricaliszt 2.4 v% (NH4)2S04 0.2 v% CaC03 0.4 v% MgS04.7Hz0 0.02 v% MnS04.4H20 0.0015 v% antihabzin A/3 1.0 v% csapvízben felvéve. (Antihabzin A/3 lásd 160 lajstrom 474 sz. magyar szabadalmi leírás.) 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 50 ml tápoldatot töltöttünk, 120 °C-on 20 percen át sterileztük, utána a pH-ja 7-7,2 volt. A tenyészeteket 30 °C-on 220 perc-1 löketszámú rázógépen 48 órán át rázattuk. A különböző törzsek bacitracin termelőképessége az alábbiak szerint alakult: MNG 00110 PP/188 NCAIM B(P) 00343 NCAIM B(P) 00344 HS-124 HS-13 320 E/ml 384 E/ml 480 E/ml 576 E/ml 310 E/ml 480 E/ml. 2. példa Foszfátkiegészités hatása Az MNG 00344 törzzsel az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a Lápoldatot 0,02 v% káliumdihidrogén-foszfáltal kiegészítettük. A titer 640 E//ml bacitracin volt, a kiegészítés nélküli tápoldatban (1. példa) 576 E/ml. 5
