197359. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bacitracin előállítására módosított Bacillus törzsek fermentálása útján
2 197359 3 A találmány tárgya eljárás bacitracin előállítására módosított baktériumtörzsek fermentálásával. A Bacillus subtilis és a Bacillus licheniformis fajokhoz tartozó törzsek között több olyan ismert, amely fokozott mértékben termel bacitracint. így például a 2 813 061 lajstromsz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás 323 E/cm3 (egység/cm3 tenyésztél mennyiségű bacitracint termelő törzset ismertet (a bacitracin-egységeket az egész leírásban a 2 498 165 lajstromsz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás szerint adjuk meg, ami azt jelenti, hogy 1 E=23,8 /mg). A 206 910 lajstromsz. csehszlovák szabadalmi leirás szerinti törzs termelése 580 E/cm3, a 173 315 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett törzsé 570- -590 E/cm3,- a 74.46 079 lajstromsz. japán szabadalmi leirás szerinti törzsé 500 E/cm3, és a 173 450 lajstromsz. csehszlovák szabadalmi leirás olyan Bacillus licheniformis törzset ismertet, amely virulens fággal fertőzve is termel 240-280 E/cm3 bacitracint. Néhány szabadalmi leírás hiánymutáns vagy hibás anyagcseréjű, illetve antimetabolit-rezisztens törzsek bacitracin-termelését is ismerteti, így például a 74.46 079 lajstromsz. japán szabadalmi leirás metionin auxotrof, a 173 315 lajtromsz. magyar szabadalmi leirás izoleucin-hidroxamát-rezisztens és a 120 267 lajstromsz. lengyel szabadalmi leirás az izoleucin hasznosítására képtelen törzset ismertet. A fenti termelési adatok összehasonlításakor kitűnik, hogy a virulens fágokkal szemben rezisztens és ezért könnyebben fermentálható törzsek termelése nem kiemelkedő, míg a jól termelő törzsek tenyészete mindig ki van téve a fág-fertőzés veszélyének. Nagy aktivitású és ugyanakkor fágokkal szemben rezisztens, bacitracint termelő törzseket eddig az irodalomban nem írtak le. A találmány feladata tehát olyan Bacillus törzsek előállítása volt, amelyek termelő képessége eléri, illetve felülmúlja a szakirodalomban közöltek termelőképességét, és fermentálásukat virulens fágok nem zavarják. További célunk volt ezen törzsek fermentálásához felhasználható újszereű paraméterek kidolgozása. Ismert, hogy kémiailag definiált tápoldatok ornitinnel történő kiegészítése több bacitr-acint eredményez [FEMS Microbiol. Letters 10(2), 111-114 (1981)]. Ismert továbbá, hogy jól termelő törzsekre a gátolt ornitin-katabolizmus jellemző [Acta Biochim. Pol. 21(2), 213-214, 1974]. Az arzenáttal szembeni rezisztencia kialakítása bizonyos esetekben csökkent mértékű (sejten belüli) foszfáttranszportot eredményez [J. Bacteriol. 137(1), 69-72, 1979). Végül ismert, hogy a protoplaszt fúzió poligénes tulajdonságok átvitelére alkalmas [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 2147-50 és 73, 2151-50, 1976], és rekombináció Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis törzsek között is lehetséges [Arch. Microbiol. 134(4); 303-308, 1983]. Felismertük, hogy a jól termelő törzsekre jellemző gátolt ornitin-katabolizmus hiánymutáns törzsek esetén is előfordulhat. Felismertük továbbá, hogy a csökkent mértékű foszfáttranszport az optimálisnál nagyobb szervetlen foszfát koncentráció mellett is magas antibiotikum hozamot eredményezhet. További felismerésünk, hogy a bacitracint rosszul vagy egyáltalán nem termelő, de virulens fágokkal szemben rezisztens törzsek protoplasztjainak interspecifikus fúziójával jól termelő, virulens fágokkal szemben reziszteris törzsek állíthatók elő. A fermentálás körülményeit illetően azt ismertük fel, hogy a termelő törzs szaporodásának és bacitracin bioszintézisének optimális hőmérséklete különbözik, valamint azt, hogy a fehérjék bomlástermékeként keletkező ammónium-ionok 70-80 mM-os koncentrációja a bacitracin bioszintézisét gátolja, ezért a szerves és szervetlen nit.rogénforrások, illetve a szón- és a nitrogénforrások arányát ennek függvényében kell beállítani. Végül felismertük, hogy a szójaliszt eredményesen helyettesíthető borsó- vagy csillagfürtliszttel, ha a táptalaj keményítő-értékét állandónak tekintjük, és a táptalaj természetes komponenseinek koncentrációját ennek, valamint a szén-nitrogén-arány figyelembevételével állapítjuk meg. (A keményitó-érték számolása az MS2 6830-53 sz. magyar szabvány szerint történik.) Mindezek alapján a találmány tárgya eljárás bacitracin előállítására módosított bacillustörzsek hömérsékletvezérelt, aerob fermentálása útján, süllyesztett tenyészetben, alkalmas szénforrást, szerves és szervetlen nitrogénforrást, nyomelemeket és pufferként kalcium-karbonátot tartalmazó tápközegben. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy a termelő törzs- hiánymutáns, vagy- arzenát-rezisztens vagy- különböző Bacillus törzsek protoplasztjainak fúziójával előállított, bacitracint jói termelő, virulens fággal szemben rezisztens Bacillus törzs, a szaporítást 37-45 °C-on, a termelést 35- -37 °C-on végezzük olyan tápközegben, amelynek keményítő értéke literenként 60-85, a szén- és a szerves nitrogénforrások aránya 0,30-0,95:1, az ammónium-ionok koncentrációja oltás előtt, legfeljebb 16 mM és a foszfát-ionok oltás előtti koncentrációja legfeljebb 5 mM. Az alábbiakban ismertetjük néhány előnyös Bacillus törzs előállítását. A kiindulási törzsek tulajdonságait az 1. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
