197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
47 197357 48 Közvetlenül a felhasználás előtt hagytuk, hogy a sejtpép hűtőszekrényben megolvadjon. 500 g megolvadt sejtpépet 5 liter ,A‘ pufferben diszpergáltunk (a pufferoldat 50 mM foszfátot, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 500 mM nátriumkloridot, 15 mM béta-merkapto-etanolt tartalmazott, a pH-értéke 7 volt). Az egyenletes szuszpenzió előállításához G-450 generátorral ellátott Tekmar Dixpax Model SD-45 diszpergáló berendezést használtunk. A diszpergálást 3 percig végeztük teljes sebességre kapcsolt berendezéssel. A szuszpenziót ezután Manton-Gaulin 15M típusú homogenizáló berendezéssel homogenizáltuk, 41 370 kPa nyomás alkalmazásával. A berendezésen kétszer vezettük át a szuszpenziót, és a két átvezetés között lehűtöttük. A homogén terméket 30 percig centrifugáltuk 4 °C-on Beckman RC3 centrifugában 5000 fordulat/perc mellett. A nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis azt mutatta, hogy a felülúszó folyadék lényegében ugyanazt a fehérjekeveréket tartalmazza, mint a centrifugálás előtti homogén anyag, lényegesen kisebb azonban a száj- és körömfájás virusfehérjének megfelelő sáv. Az üledék mintegy a felét tartalmazta az eredeti sejtpép mennyiségének, a felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük. Az üledéket olyan módon mostuk, hogy friss .A’ pufferoldatban diszpergáltuk Dispax SD-45 diszpergáló berendezés alkalmazásával, 2 liter pufferoldatot véve 200 g szemcsére. A szuszpenziót ismét centrifugáltuk a Beckman RC3 centrifugában 4 °C-on 30 percig, 5000//perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük. A 137 g mennyiségű üledék a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisnél megnövelt nagyságú, a száj- és körömfájás vírusfehérjének megfelelő sávot mutatott, amely az üledék fehérjetartalmának mintegy 50%-át képviselte. Az üledékből ezután extraháltuk a száj- és körömfájás virust bevonó fehérjét oly módon, hogy 1 liter ,B' pufferoldatban szuszpendáltuk Dixpax SD-45 berendezés alkalmazásával. A .B' pufferoldat 50 mM foszfátot, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 15 mM béta-merkapto-etanolt és 7 M guanidin-hidrokloridot tartalmazott, s a pH-értéke 7 volt. A szuszpenziót egy éjszakán át kevertük, majd centrifugáltuk Sorvall SS-34 rotor alkalmazáséval 19 000/perc fordulatszámon, 3 órán át 4 °C-on. Az üledéket eldobtuk, a száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjét tartalmazó oldatot pedig kromatografáltuk Sephacryl S- 300 gyanta (gyártó: Pharmacia) alkalmazásával. Először hagytuk, hogy egyensúly alakuljon ki a gél és a .B‘ pufferoldat között, majd 5 cm átmérőjű és 50 cm magasságú oszlopba töltöttük a gyártó cég útmutatása szerint. A hézagtérfogatot kitöltő frakciók (270 ml-töl kezdve) zavarosak voltak, jóllehet az oszlopra felvitt oldat nem volt zavaros. A száj- és körömfájás vírusfehérjét tartalmazó frakciók 450-650 ml térfogatnál voltak elkülöníthetők. Ezek a frakciók tiszta oldatok voltak. A száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjét úgy azonosítottuk, hogy a frakciók alikvot részeit dializáltuk 8 M karbaraid-oldattal szemben, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében poliakrilamidgél-elektroforézissel analizáltuk. (A guanidint a nátriura-dodecil-szulfát kicsapja, ezért előbb el kell távolítani). A száj- és körömfájás vírusának fehérjebevonatát tartalmazó frakciókat elegyítettük és dializáltuk 20-szoros feleslegben vett .C" pufferoldattal szemben (14 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, 15 mM béta-merkapto-etanol, 8 M karbamid, pH=8,3) 4 °C-on. A dialízis során négyszer cseréltük ki a pufferoldatot. (A dialízissel a 8 M karbamid-oldat biztosította a guanidin-hidroklorid helyett a fehérje oldatban tartását). A visszatartott folyadék vagy alikvot részét nátrium-hidroxiddal pH=10-ig lúgositottuk, és 1,0 cmxl9 cm méretű, DE-52 töltettel ellátott oszlopon vezettük át, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk nátrium-hidroxiddal pH=10 értékre beállított .C' pufferoldattal. A fehérjét nem tartotta vissza a gyanta, ugyanakkor az Escherichia coli-tói származó szennyező anyagok túlnyomó részét megkötötte. A gyantáról távozó folyadék fehérjetartalmának 96%-a a száj- és körömfájás vírusának fehérjéje volt a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis alapján. Ez azt jelenti, hogy 1 kg sejtpépből 30 g terméket nyertünk ki, azaz a termelés 90% körüli. A kapott, fehérjét tartalmazó oldat felhasználható végtermékként, ha a karbamid jelenléte megengedhető az aktív anyag beadásánál. A fentiek szerint kapott készítményből a karbamidot úgy távolitottuk el a fehérje kicsapása nélkül, hogy először 4 rag/ml koncentrációjú fehérje-oldatot díalizáltunk 250- -szeres feleslegben vett 1 M karbamid-oldattal szemben, amely még 14 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt és 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmazott, s a pH-értéke 7 volt, 4 °C-on, majd a visszatartott oldatot vízzel szemben dializáltuk. Enyhe zavarosodás jött létre, ezt azonban centrifugálással megszüntettük. A száj- és körömfájás virusfehérjének kicsapódását vízben vagy pufferoldatban nyilvánvalóan az akadályozta meg, hogy fokozatosan csökkentettük a karbamid koncentrációját. A kapott fehérje biológiailag aktivr volt, amit a száj- és körömfájás antiszérumával adott reakció, a .Western biot’ vizsgálat, továbbá az az in vivo vizsgálat mutatott, hogy szarvasmarhán immunreakciót hozóit létre. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
