197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
49 197357 50 Sertés növekedési hormon tisztítása Többlépéses eljárás A 4. példában leirt Escherichia coli K-12 W3110/pPGH-exl törzset az 1. példában ismertetett módon tenyésztettük 30-50 optikai sűrűség egység eléréséig. A táptalaj literenként 40 g nedves sejtpépet tartalmazott. A tenyészet fenol- és toluolkoncentrációját 0,25%-ra állítottuk be, majd 30 perc múlva a táptalajt centrifugáltuk, és a sejtpépet tárolás céljából megfagyasztottuk. Közvetlenül a felhasználás előtt hagytuk, hogy 384 g sejtpép megolvadjon hűtőszekrényben, és 3,9 liter hideg .A' pufferoldatban diszpergáltuk. A pufferoldat 50 mM foszfátot, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 500 mM nátrium-kloridot tartalmazott, és a pH-értéke 7 volt. Tekmar Dispax Model SD-45 diszpergáló berendezést használtunk, amely G-450 generátorral volt ellátva, és 3 percig működtettük a berendezést a 60-as beállításon. A kapott egyenletes szuszpenziót Manton-Gaulin 15 M típusú homogenizáló berendezéssel homogenizáltuk, 44 820 kPa nyomás alkalmazásával. A szuszpenziót kétszer vezettük át a berendezésen, és a két átvezetés között hűtést alkalmaztunk. A 4,3 liter homogenizált szuszpenziót Sorvall RC3 rotor alkalmazásával centrifugáltuk 4 °C-on 30 percig 5000/perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékot dekantáltuk, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kimutattuk, hogy lényegében ugyanazt a fehérjekeveréket tartalmazza, mint a homogenizált szuszpenzió a centrifugálás előtt, csak jelentősen csökkent benne a sertés növekedési hormonnak megfelelő sáv. A felülúszó folyadékot elöntöttük, az üledéket pedig friss .A" pufféról datban diszpergáltuk a Dispax SD-45 berendezés alkalmazásával. 150 g mennyiségű üledékhez 1,5 liter pufferoldatot használtunk. A szuszpenziót ismét centrifugáltuk az RC3 rotor alkalmazásával, 5000/perc fordulatszámon, 35 percig 4 °C-on. A felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük. A 106 g mennyiségű üledéket 750 ml ,B' pufferoldatban oldottuk [amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 100 mM béta-merkapto-etanolt és 7 M guanidin-hidrokloridot tartalmaz, pH-értéke 8,8], Dispax SD-45 berendezés alkalmazásával, és egy éjszakán át kevertük az oldatot. A zavaros oldatot Sorvall SS-34 rotor alkalmazásával centrifugáltuk 19 000/perc fordulatszámon 6 órán át 4 °C-on, és a szemcsét kidobtuk. A 740 ml összmennyiségű felülúszó folyadékból 690 ml-t szobahőmérsékleten kromatografáltunk 10 cm átmérőjű és 85 cm 11. példa hosszúságú Sephacryl S-300 oszlopon (gyártó Pharmacia). Az oldatot kétszer két részletben (350 ml és 340 ml) kromatografáltuk. Az egyensúly kialakitásához 7 M guanidin-hidroklorid-oldatot használtunk, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 50 mM béta-merkapto-etanolt tartalmazott, pH-értéke 8,9 volt. Az oszlopról távozó frakciók alikvot részeit dialízisnek vetettük alá egy olyan oldattal szemben, amely 8 M karbamidot, 0,1% béta-merkapto-etanolt és 25 mM trisz(hidroxi-etil)-amino-metánt tartalmazott, és pH-értéke 7 volt, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel analizáltuk, hogy meghatározzuk a sertés növekedési hormon jelenlétét. A sertés növekedési hormont tartalmazó frakciókat elegyítettük és 4 °C-on dializáltuk. A dialízishez 20-szeres feleslegben vett oldatot használtunk, amely 15 mM trisz(hidroxi-nietil)-amino-metán-hidx-okloridot, 50 mM béta-merkapto-etanolt, 7 M karbamidot tartalmazott, és a pH-értéke 9,0 volt. A dialízis során négyszer cseréltük ki a fenti oldatot. A 3900 ml mennyiségű visszatartott folyadékot sósavval pH=7,0 értékre állítottuk be, és 10 cmxll,5 cm méretű DE-52 oszlopon vezettük át, miután a gyantát szobahőmérsékleten egyensúlyba hoztuk egy olyan, 7,0 pH-értékű oldattal, amely 15 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 50 mM béta-merkapto-etanolt és 7,5 M karbamidot tartalmazott. Az oszlopot a térfogatának megfelelő mennyiségű, az egyensúly kialakításához használt pufferoldattal azonos összetételű oldattal mostuk a sertés növekedési hormon eltávolítása érdekében. A DE-52 oszlopról elvezetett 4000 ml folyadékot nátrium-hidroxiddal pH=10 értékig titráltuk, majd Spectrapor 1 készülékben dializáltuk háromszor 100 liter mennyiségű, 25 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt és 1% mannitot tartalmazó, pH=10 értékű oldatokkal szemben, 4 °C-on. A visszatartott folyadékot a dializátummal 10,4 literre hígítottuk, szűréssel sterileztük és liofilizáltuk. 10 g biológiailag aktív fehérjét kaptunk, amely a .Western biot" vizsgálat alapján 98%-os tisztaságú sertés növekedési hormon volt. 12. példa Prorennin konformációjának kialakítása szulfitolizissel A prorennint kódoló gént hordozó Escherichia coli K-12 W3110/pRIAK törzs (amelyet a 83 307 841.3 és 83 307 842.1 sz. európai szabadalmi bejelentések ismertetnek) tenyésztésével kapott sejtpép 432 g mennyiségét 3 liter pufferoldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot és 5 mM etilén-diamin-tet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 26
