197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
25 197357 26 ennek megfelelő, kis mennyiségű diszulfid vegyület jelenlétében. A diszulfid vegyületet vagy közvetlenül hozzáadjuk az oldathoz, vagy egyedül a szulfhidril vegyületet használjuk, azonban nem fordítunk gondot a levegő kizárására. Ekkor olyan oxidáló atmoszféra alakul ki, amelyben már képződik bizonyos mennyiségű diszulfid. A szulfitolizist általában úgy végezzük, hogy az erősen denaturáló közegben, például 4-9 M guanidin-hidroklorid-oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjéhez 5- -200 mg/ml, előnyösen 15-30 mg/ml nátrium-szulfitot vagy megfelelő moláris mennyiségű egyéb szulfitsót adunk annyi enyhe oxidálószer jelenlétében, amely elegendő a reakció folytán képződő esetleges szulfhidrilcsoportokból a diszulfid regenerálására. Alkalmas oxidálószer például a molekuláris oxigén katalizátorként fémkationok jelenlétében, vagy a nátrium-tetrationát. Előnyös oxidálószer a nátrium-tetrationát. A nátrium-tetrationátot 1-20 mg/ml, előnyösen 10 mg/ml mennyiségben alkalmazzuk. Megfelelő ekvimoláris mennyiségű egyéb oxidálószert is használhatunk. Az oldatot ezután 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán át állni hagyjuk, 15-35 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten. Jóllehet megadtunk alkalmas koncentráció- és hőmérséklettartományokat, a pontos reakciókörülmények, amelyek a legelőnyösebbek, természetesen függnek annak a fehérjének a tulajdonságaitól, amelynek a szulfitolizisét el akarjuk végezni. Továbbá, néha hasznos, ha csak .részleges’ szulfitolizist végzünk. Ebben az esetben lényegesen kisebb mennyiségű szulfit és oxidálószer elegendő. Lásd például a 13. példát. A fentebb megadott mennyiségek csupán útmutatásul szolgálnak, és a szélső értékeket különböző paraméterek határozzák meg, így az oldatban lévő fehérje mennyisége és az elérni kívánt szulfitolizis mértéke. A fenti szulfitolizisnél felhasadnak a diszulfid-kötések, és egy szulfonátcsoport kapcsolódik a diszulfid-kötésben részvevő egyik kénatomhoz. Úgy véljük, hogy ennél a reakciónál a szulfition nukleofil támadással felhasitja a diszulfid-kötést. A kialakuló kötés minden esetben fehérje-S-SOs, azaz fehér je-S-szulfonát. A képződő fehérje-S-szulfonátot gyengén denaturáló oldatba visszük át, vagy hígítással vagy puffercserével, például dialízis segítségével karbamidot tartalmazó oldatba. Megjegyzendő, hogy további tisztítást végezhetünk például ioncserélő kromatográfia vagy más szokásos fehérjetisztitó módszer alkalmazásával, miközben a fehérje még az S-szulfonált alakban van jelen. A gyengén denaturáló közeg lehetőséget ad a megfelelő konformáció kialakulására, mivel a fehérje már nem tartalmaz helytelen diszulfid-kőtéseket. Ha gyengén denaturáló oldatként karbamid-oldatot használunk, a megfelelő koncentrációtartomány 1-9 M, előnyösen 6-8 M. A pH-értékét 5-9 között, előnyösen 6-8 között tartjuk alkalmas pufferrel, amelyhez adott esetben etilén-tetraecetsavat vagy más kelátképzót adunk. Ha hígítással biztositjuk a gyengén denaturáló oldatot, akkor az eredeti erős denaturálószert 0,5-2 M koncentrációra higítjuk. A gyengén denaturáló közeghez a következő komponensekből álló rendszert adunk: szulfhidril vegyület (RSH) és a megfelelő diszulfidja (RSSR), például béta-merkapto-etanol, redukált glutation, ciszternáin vagy cisztein és a megfelelő oxidált vegyületek. Az alkalmazott rendszer előnyösen a glutation redukált alakjából (GSH) és oxidált alakjából (GSSG) áll. A pH-t olyan értékre állítjuk be, hogy a szulfhidril vegyület (RSH) legalábbis részben ionizált alakban (RS‘) legyen, úgy, hogy növeljük a szulfonát nukleofil átalakítását, úgy is eljárhatunk, hogy egyedül a redukált vegyületformát használjuk a levegő jelenlétében, mivel ekkor elegendő mennyiségű diszulfid képződik. Az RSH/RSSR mólarány általában 20:1-5:1, előnyösen körülbelül 10:1, és az összes glutation vagy egyéb reagens koncentrációja 0,05-5 millimól. Az elegyet a fehérjétől függően 0- -37 °C-on inkubáljuk 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán át. A szulfhidril vegyület maga elegendő lenne ahhoz, hogy a fehérje-S-szulfonát átalakuljon a megfelelő diszulfiddá, vagy legalább is diszulfid-kőtéseket képezzen magával a szulfhidril vegyülettel, az oxidált formára azonban ahhoz van szÜBég, hogy a megfelelő diszulfid-kötések sértetlenek maradjanak. Abban az esetben, ha tiszta szulfhidril vegyületet használunk olyan körülmények között, amikor oxidációra nincs mód, a fehérje végül is a szulfhidríl-alakban lesz jelen, és nem diszulfidként. Ennek megakadályozására fenntartjuk a környező puffer oxidáló képességét kis mennyiségű diszulfid biztosításával, amelyet közvetlenül adunk az oldathoz, vagy a redukált szulfhidrilből a levegő hatására bekövetkező oxidációval alakitünk ki. Az oldat most már a megfelelő csavarodottságú fehérjét tartalmazza, s a kívánt konformációt feltehetően rögzítették a helyes diszulfid-kötések, ezért az oldatból adott esetben eltávolíthatjuk a denaturálószert egy olyan pufferoldattal szemben végzett dialízissel, amelynek a pH-értéke 5-9 és adott esetben kevés redukált glutationt vagy más szulfhidril' vegyületet tartalmaz 1 mM körüli koncentrációban. Erre a műveletre azonban nincs szükség akkor, ha a fehérje a denaturálószer jelenlétében is felhasználható. A fentebb ismertetett eljárásnál a fehérje koncentrációját eléggé kis értéken, előnyösen 1 mg/ml alatt tartjuk, mivel némelykor - bár nem mindig - a nagyobb koncentrációk hátrányosak a reakció lefolyásához. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
