197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
27 197357 28 A szulfitolizist karbamid vagy más gyenge denaturálószer oldatában éppúgy kivitelezhetjük, mint erősen denaturáló oldatban, és előnyös is lehet, ha így teszünk, különösen olyankor, amikor különösen nagy az oldáshoz használt denaturálószer-koncentráció. Ilyen esetekben inkább a szulfitolizis előtt, semmint utána végezzük el a puffercserét a gyengébb denaturálószer oldatába, vagy a higitást. A találmány szerinti eljárásnak a heterológ fehérje megfelelő konformációjának kialakítását célzó másik változatánál a fehérje kiegyenesitését és visszacsavarását ugyanabban az oldatban vitelezzük ki oly módon, hogy a fehérjét vagy peptidet szulfhidril/diszulfid-tartalmú pufferbe helyezzük, amely puffer elegendő denaturáló képességgel rendelkezik ahhoz, hogy a közbenső konformációk mindegyike oldható maradjon a fehérje kiegyenesitése és visszacsavarása folyamán. Alkalmas közeg például a karbamidot 1-9 M koncentrációban, előnyösen 7 M körüli koncentrációban tartalmazó oldat, amely eléggé gyenge denaturálószer ahhoz, hogy jól megközelíthetővé váljon a helyes konformáció, ugyanakkor eléggé erős denaturálószer ahhoz, hogy megmaradjon a visszacsavarodó lánc mozgékonysága és a közbenső konformációk oldhatósága. Ez az eljárás .redox pufferben történő visszacsavarás ' kifejezéssel jellemezhető. A megfelelő kicserélő közegben a szulfhidril vegyületeknek, például a béta-merkapto-etanolnak, glutationnak, ciszteaminnak vagy ciszteinnek, előnyösen a glutationnak mind a redukált (RSH), mind pedig az oxidált (RSSH) alakja jelen van. Ennél a redox pufferben történő visszacsavarásnál az RSH/RSSR mólarány általában 20:1-5:1, előnyösen körülbelül 10:1, a teljes reagenskoncentráció pedig 0,05-5 mM. Eléggé nagy pH-értékre van szükség ahhoz, hogy biztosított legyen az RSH legalább is részleges ionizálása, jóllehet nem kell olyan nagy pH-érték, mint a fehérje denaturálásához. Az elegyet 0-37 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 5 °C körüli hőmérsékleten inkubáljuk 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán át. Ugyanúgy, mint fentebb, a szulfhidril vegyület redukált és oxidált alakjának egyidejű jelenlétét vagy közvetlenül biztosítjuk, vagy a szulfhidril vegyület levegő segítségével lejátszódó oxidációjával. A szulfhidril vegyület mindkét formájára szükség van a megfelelő oxidáló képesség fenntartásához, hogy kiküszöböljük a fehérje teljes redukcióját. Hasonló módon, mint a helyes konformáció kialakítását célzó többi találmány szerinti eljárásváltozatnál, a még oldatban lévő fehérjét. ismert fehérjetisztitó módszerekkel, például gélszűréssel vagy ioncserével kezelhetjük. Különösen előnyös ioncserélő módszer alkalmazása, például DEAE cullulóz segítségével. A találmány szerinti eljárás egy további változata értelmében a konformáció kialakítását a tisztítás során úgy végezzük, hogy a fehérjét redukált alakban tartjuk, bármilyen tisztító műveleteket alkalmazunk is, majd a denaturálószer végleges eltávolításakor levegő jelenlétében végzett újraoxidálással alakítjuk ki a megfelelő diszulfid-kötéseket. Ennél az eljárásnál a fénytöréssel rendelkező fehérje erős denaturálószerrel készült kezdeti oldatához redukálószert adunk, s a redukálószer jelenlétét valamennyi későbbi tisztító műveletnél is biztosítjuk. Alkalmas redukálószer például a béta-merkapto-etanol, ditiotreitol és a redukált glutation. Előnyös a béta-merkapto-etanol. Amikor az eljárás végén a denaturálószer legnagyobb részét vagy teljes mennyiségét eltávolitottuk, mér nem adunk további redukálószert a reakcióelegyhez, és elegendő mennyiségű levegő van jelen ahhoz, hogy a most már megfelelő konformációjú fehérjében a szulfhidrilcsoportokat diszulfid-kötésekké oxidálja vissza, és így rögzítse a helyet natív formát. Ezt a találmány szerinti eljárást a 10. és 11. példában mutatjuk be. H. Általános többlépéses eljárás A 2. folyamatábrán mutatjuk be azokat a lépéseket, amelyekre szükség van a tisztítást célzó általános többlépéses eljáráshoz. A 2. folyamatábrán még két további fakultatív lépést is feltüntettünk. A vázolt többlépéses eljárás szintén a találmány tárgyát képezi. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 15
