197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
3 197357 4 A találmány tárgya eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására. A dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológia lehetővé teszi, hogy exogén vagy idegen (heterológ) fehérjéket termeljünk baktériumokban vagy más .gazda’-sejtekben. Bizonyos körülmények között és egyes fehérjék esetén ezek a heterológ fehérjék kicsapódnak a sejteken belül fénytöréssel rendelkező testek alakjában. A találmány olyan eljárásokra vonatkozik, amelyekkel kinyerhetjük ezeket a heterológ fehérjéket, és kívánt esetben helyreállíthatjuk aktív formájukat. Nagy számú - emberi, emlősállatoktól származó vagy egyéb eredetű - fehérjét, például emberi növekedési hormont (hGH), szarvasmarha növekedési hormont (bGH) és különféle interferonokat állítottak elő gazdasejtekben oly módon, hogy a sejteket olyan dezoxiribonukleinsavval látták el, amelyek ezeket a fehérjéket kódolják, és a kapott sejteket az új heterológ fehérje termelésének kedvező körülmények között tenyésztik. A gazdasejtekben DNS-rekombinációs technológiával termelt heterológ fehérjékre további példák a következők: virusbevonó fehérjék, Így a száj és körömfájás vírusának külső fehérjéi és a hepatitisz B vírus felületi antigén fehérjéje. A heterológ fehérje gyakran a sejten belül csapódik ki, és jelentős részét képezi a teljes sejtfehérjének. Nagy számú fontos esetben, például az emberi növekedési hormon, sertés növekedési hormon (pGH), szarvasmarha növekedési hormon, száj és körömfájás virus és a fibroblaszt interferon (F1F) esetén megfigyelték, hogy a termelt heterológ fehérjék nem csupán nagy mennyiségben vannak jelen, hanem kicsapódnak a sejten belül fénytöréssel rendelkező testek alakjában. A .fénytöréssel rendelkező" kifejezést azért használjuk, mivel ezek a testek fáziskontraszt mikroszkóp segítségével láthatók. Már 1000-szeres nagyításban is ezek a kicsapódott fehérjék fényes foltokként jelennek meg, amelyek a sejten belül láthatók. Az ilyenfajta, fénytöréssel rendelkező testek alakjában lévő fehérje kinyerése több problémát is felvet. Először, nyilvánvalóan szükség van arra, hogy elválasszuk a sejten belül elhelyezkedő, fénytöréssel rendelkező fehérjét a sejt anyagától és azoktól a fehérjéktől, amelyek a kívánt fehérjét a sejthez rögzítik. Másodszor, jóllehet a fénytöréssel rendelkező test gyakran nagy százalékban tartalmazza a kivánt heterológ fehérjét, egyes esetekben jelentős mennyiségű szennyező anyag is jelen van, amelyeket el kell távolítani ahhoz, hogy elkülönithessük a kivánt polipeptid szekvenciát. Harmadszor, és talán ez okozza a legnagyobb nehézséget, a fénytöréssel rendelkező test alakjában lévő fehérje azonosítható ugyan a kivánt fehérjeként, azonban biológiailag nem aktív. A szakemberek úgy vélik, hogy ez az inaktivitás annak a következménye, hogy a hetei'ológ fehérje .csavarodottsága" vagy konformációja nem megfelelő akár a sejten belüli kicsapódás előtt vagy után, akár az elkülönítés folyamán. Azt találtuk, hogy ezeket a nehézségeket leküzdhetjük olyan műveletek alkalmazásával, amelyek során eltávolítjuk a szennyező gazdasejtfehérjét, szolubilizáljuk a kicsapódott, fénytöréssel rendelkező fehérjét, és olyan alakban állítjuk helyre a heterológ fehérjét, amelyben aktív a biológiai vizsgálatoknál. A találmányt a következőkben foglalhatjuk össze: Általános megoldást biztosítunk a fenti problémára, amely abból áll, hogy aktiv alakban különítünk el gazdasejtekben termelt, azokhoz heterológ, és legalább is részben a sejteken belüli fénytöréssel rendelkező testek alakjában kivált fehérjéket, azaz oldhatatlan fehérje rögöket. A találmány szerinti eljárást, amellyel hatékonyan nyerhetünk ki heterológ fehérjéket olyan sejttenyészetekből, amelyekben fénytöréssel rendelkező testek képződtek, az 1. folyamatábrán mutatjuk be vázlatosan, a különféle alternatívákkal együtt. A leírás egy későbbi részében bemutatott 1. folyamatábra, röviden ismertetve, több szakaszból áll. Először felszabadítjuk a sejtekből a kicsapódott oldhatatlan fehérjét. Az ehhez alkalmazott módszer megbontja a külső sejtfalat/membránt megfelelő ionerősség és pH-érték alkalmazásával úgy, hogy a gazdasejt fehérjéi - feltéve, hogy a sejtek megbontása kielégítő mértékű - szolubilizálódnak, vagy legalább is nem különülnek el a felülúszó folyadéktól kissebességű centrifugáláskor. Ennek megfelelően a centrifugáláskor a kivánt, fénytöréssel rendelkező fehérje a szemcsében halmozódik fel, a szennyező fehérjék pedig fótömegükben a felülúszó folyadékban maradnak. A centrifugálással nyert szemcse azonban különböző okokból kifolyólag tartalmazhat még szennyező fehérjét. Először is lehetséges, hogy az eredeti, fénytöréssel rendelkező test nem csak a kivánt fehérjéből áll. Másodszor, előfordulhat, hogy sejtfal- vagy sejtmembrán-töredékek nem lettek eléggé elbontva, és ezért a szemcsével együtt különülnek el, és esetleg még a szemcse mikroszkóppal végzett tanulmányozásakor sem vészszűk őket észre. Ennek ellenére a kapott szemcse túlnyomórészt a kívánt fehérjéből áll, és eltérően az enzimológiai vizsgálatoknál alkalmazott szokásos fehérjetisztitási eljárások esetén tapasztalt helyzettől, a feladat a szennyező anyagok eltávolítása egy alapvetően tiszta termékből, és nem egy kis mennyi5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
