197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
5 197357 6 ségben jelenlevő komponens elkülönítése egy bonyolult elegyböl. (Egyes esetekben, nevezetesen az emberi növekedési hormonnál, a baktérium vagy más gazda organizmus által termelt heterológ fehérje csak részben van jelen fénytöréssel rendelkező alakban, amikor a sejtek növekednek és termelik a fehérjére vonatkozó gént. Ilyen esetben azt tapasztaltuk, hogy a centrifugálással elkülönített szemcsében lévő kívánt fehérje mennyiségét növelhetjük, ha a sejteket a megbontás előtt olyan kezelésnek vetjük alá, amelyek célja hagyományosan a sejtek elpusztítása volt, a DNS-rekombinációval transzformált sejtekre vonatkozó biztonsági óvórendszabályoknak megfelelően. Például a savval, hővel vagy apoláros oldószerekkel végzett kezelés biztosítani látszik a részlegesen oldható fehérjék oldhatatlanná tételét. ) Miután olyan termékhez jutottunk, amely túlnyomórészt a kívánt fehérjéből áll, a feladat az, hogy a fehérjét egyes esetekben tovább tisztítsuk, és olyan alakban nyerjük ki, amelyben a biológiai aktivitása hasznosítható. Tekintettel arra, hogy a fehérje in vivo csapódott ki a citoplazmában fennálló körülmények között, nyilvánvaló, hogy a hagyományos szolubilizáló módszerek nem vezetnek eredményre. Ennek megfelelően erőteljesebb módszerre van szükség ahhoz, hogy oldatba vigyük ezt a fehérjét, és Így az felhasználható legyen. Azt tapasztaltuk, hogy egy erős denaturáló oldattal hatékonyan elvégezhetjük ezt, ugyanakkor a képződött oldat esetleg nem biztosit biológiailag aktiv készítményt. Amikor ezt az oldatot, amely erős denaturálószert és szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjét tartalmaz, fel akarjuk használni a biológiai aktivátás kimutatásához - amint azt a megfelelő tesztek mutatják -, a legnyilvánvalóbb alternatívák nem adnak kedvező eredményeket: Ha szükség van higitásra, természetesen ugyanennek az .oldószernek' a nagyobb mennyiségével, azaz további erős denaturáló oldattal való hígítás a biológiai vizsgálathoz megkívánt koncentráció eléréséig, nem kívánatos, mivel maga az erős denaturálószer zavar a biológiai aktivitás mérésénél. Hig pufferoldattal vagy vízzel szintén nem hígíthatjuk fel az oldatot, mivel a fénytöréssel rendelkező fehérje ekkor ismét kicsapódik, szinte elkerülhetetlenül. Ha a hígítás nem eredményez kicsapódást, akkor is többnyire nem kapjuk meg a várt aktivitásértéket. Létezik néhány eredményes alternatíva biológiailag aktiv termékek kinyerésére, és ezek az eljárások összhangba hozhatók a találmány szerinti tisztitó eljárással. Az egyik ilyen megoldásnál az erős denaturálószert gyengébbel helyettesítjük, majd csökkentjük a gyenge denaturálószer koncentrációját. Úgy tűnik, hogy ezzel az eljárással megőrizzük a fénytöréssel rendelkező fehérje oldhatóságát, és olyan közeget biztosítunk, amely nem befolyásolja a biológiai aktivitást. Jóllehet azt tapasztaltuk, hogy egyes esetekben ez az eljárás önmagában nem eredményez pozitív biológiai aktivitást, más esetekben azonban kedvező eredményt adott. Erre példa a száj és körömfájás vírusát bevonó fehérjét magába foglaló összekapcsolt fehérje. Úgy tűnik, hogy hasonló helyzet áll fenn az állati növekedési hormonoknál. Ilyen esetekben elegendő, ha a szemcsét erős denaturálószerben oldjuk, puffercserével gyenge “denaturálószert biztosítunk vagy korlátozott mértékű hígítással gyengitjük a kaotropizmust, és kívánt esetben további tisztítást végzünk, ismert módszerek alkalmazáséval, végül fokozatos puffercserével higabb oldatot hozunk létre. A jelenleg ismert adatok szerint azonban úgy tűnik, hogy inkább kivételnek, mint szabálynak tekinthető ennek az eljárásnak az eredményessége a biológiailag aktív fehérje kinyerésénél. Sok esetben nyilvánvalóan gondoskodnunk kell az oldatba vitt fehérje .újradenaturálásáról'. A bekövetkezett denaturálódást okozhatja az, hogy már eredetileg a baktériumban és/vagy az elkülönítés körülményei között a fehérje nem megfelelő .csavarodottsága' alakul ki. Minden esetben ésszerűnek látszik, ha a kővetkező eljárások valamelyikével végezzük a kapott fehérje .kiegyenlítését' és .visszacsavarását'. Mindhárom eljárásnál puffercserével gyenge denaturálószert hozunk létre (és az egyes esetekben önmagában is elegendő) a diszulfidkőtések újbóli kialakítása előtt. Az egyik eljárásnál a fehérjét egyszerűen tovább tisztítjuk redukáló körülmények között, amelyek garantálják, hogy az esetleges diszulfidkőtések szulfhidrilcsoportokká alakuljanak át, és így lehetővé váljon a molekula megfelelő konformációjának kialakulása a tisztítás körülményei között, majd levegő vagy más oxidálószer segítségével újra kialakítjuk a diszulfidkötéseket, miután a fehérje megfelelő csavarodottsága (konformációja) létrejött. Egy másik eljárás értelmében az esetleg hibásan kialakult diszulfidkötéseket felhasitjuk a fehérje szulfonálásával, ismét hagyjuk, hogy a fehérje kívánt csavarodottsága létrejöjjön kedvezőbb körülmények között, majd újból létrehozzuk a diszulfidkötéseket a szulfonát eltávolításával, szulfhidril reagenst használva mind a redukált, mind pedig az oxidált (diszulfid) alakjában. Egy harmadik alternatíva az, hogy hagyjuk, hogy a megfelelő konformáció alakuljon egy alkalmas oldatban, olyan körülmények között, amikor állandóan képződnek és átalakulnak szulfhidril- és diszulfidcsoportok. Úgy tűnik, hogy minden esetben az a legkedvezőbb, ha ez az .újradenaturálódási folyamat' egyidejűleg megy végbe a fehérje 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
