197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
14 197356 15 videbbre szabott plazmidokat * csillaggal jelöltük). A pH 154/25 plazmidot (a gyártó előírása szerint) PvuII enzimmel reagáltatjuk, amikor is három fragmens keletkezik: 1. fragmens: a proinzulin PvuII-vágóhelyétől a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-vágóhelyig; 2. fragmens: a trp- promoter hoz közeli PvuII-vágóhelytől a proinzulin PvuII-helyéig; 3. fragmens: a trp-promotorhoz közeli PcuII-helytől a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-helyig-A fragmenseket agarózon végzett elektroforézissel (Maniatis és mts-i, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982) szétválasztjuk. Az 1. és 2. fragmenst .blunt end’ körülmények között T4 DNS-ligázzal összekapcsoljuk. E. coli 294 mikroorganizmusba transzformálva megvizsgáljuk, hogy melyek azok a telepek, amelyekben a teljes proinzulin-szekvenciát tartalmazó plazmid előfordul, azaz a fragmensek a kívánt módon elrendeződtek. A pH154/25* plazmidot a 11. ábra mutatja. Az expressziót az előző példákban leírtak szerint végezzük. A fúziós protein hozama észrevehetően nagyobb. 14. példa A pH154/25* plazmidot (13. példa, 11. ábra) Hindin és Sáli enzimekkel bontjuk, és a kisebb fragmenst (amely a proinzulin-szekvenciát tartalmazza) gél-elektroforetikusan elválasztjuk. A nagyobb fragmenst izoláljuk és az (N10) képletű szintetikus DNS-sel (Ala) Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu (Gly) (Arg) A GCT TGG GAG CCT ATG ATC GAG GG (N10) ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT ligáljuk. A plntl3 plazmidot (12. ábra) kapjuk. Az (N10) képletű DNS olyan aminosav-szekvenciát kódol, amelyben több hasítási hely van kémiai hasítás elvégzésére: a) Met a brómciános hasításhoz, b) Trp az N-bróm-szukcinimiddel (NBS vagy BSI) végzett hasításhoz, c) Asp-Pro a proteolitikus hasításhoz, ahol az előtte lévő Glu az Asp-Pro-kötést még savérzékenyebbé teszi. Azáltal, hogy az (N10) képletű HindlII-Sall-linkert egy kódolt polipeptid olvasókeretébe illesztettük, a kémiai hasítás fent említett lehetőségeit biztosítottuk, a kívánt protein aminosav-szekvenciája vagy hasitó ágensekkel szembeni érzékenysége függvényében. Az ábrák nem méretarányosak. 1. melléklet Aminosav-szekvencia 23 Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile Tyr 10 Arg Asn His lie Pro Ala Gin Thr Leu Ile 20 Glu Arg Leu Ala Thr Met Ser Asn Pro Val 30 Leu Met Leu Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro 40 Ser Glu Alá Gly Cys Met Pro Glu Leu 50 Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Pro Ile Ile 60 Gly Ile Cys Leu Gly His Gin Ala lie Val 70 Glu (93) Ala 1. Melléklet DNS-szekvencia Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile AGC AAT GGG CAT AAC GTG GTG ATT 10 Tyr Arg Asn His Ile Pro Ala Gin TAC CGC AAC CAT ATA CCG GCG CAA 20 Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr ACC TTA ATT GAA CGC TTG GCG ACC 50 30 Met Ser Asn Pro Val Leu Met Leu ATG AGT AAT CCG GTG CTG ATG CTT 40 Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser TCT CCT GGC CCC GGT GTG CCG AGC 100 Glu Ala Gly Cys Met Pro Glu Leu GAA GCC GGT TGT ATG CCG GAA CTC 50 Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu CTC ACC CGC TTG CGT • GGC AAG CTG 150 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
