197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
8 197356 9 A fentieknek megfelelően készítjük a többi oligonukleotideket is. c) A ptrpE5-l palzmidot [R.A. Hallewell és mts-i, Gene 9 (1980) 27-47] a Hindii! és Sáli restrikciós enzimekkel (a gyártó előírása szerint) vágjuk és a mintegy 620 bázispáros DNS-fragmenst eltávolítjuk. Az (N4) és (N5) képletű szintetikus oligonukleotideket 5’ AGC TTC CAT GAC GCG T 3’ (N4) 5’ ACG CGT CAT GGA 3’ (N5) foszforilezzük, együttesen 37 °C-on inkubáljuk, majd DNS-ligázzal a proinzulint kódoló tompa végű DNS-hez addicionáltatjuk [W. Wetekam és mts-i, Gene 19 (1982) 179-183]. Hindin és Sáli enzimekkel végzett kezelés után a most már meghosszabbitott proinzulin-DNS-t a T4 DNS-ligáz enzimmel kovalensen beépítjük a kinyitott plazmidba (2. ábra), így a pH1067/4 plazmidot kapjuk. A plazmidot először még egyszer Sáli enzimmel reagáltatjuk, az átlapoló végeket Klenow-féle polimerázzal tompa végekké kiegészítjük, majd a plazmidot MstI enzimmel inkubáljuk. Mintegy 500 bázispáros DNS- fragmenst izolálunk, amely a proinzulin komplett kódoló részét és az E. coli trp-operonjának D-proteinjéből mintegy 210 bázispáros szakaszt tartalmaz. A DNS-fragmens tompa végű; a pH120/14 plazmid Stul-helyébe juttatjuk (3. ábra), aminek során a pH154/25 plazmid keletkezik. Ez a plazmid a trp-operon ellenőrzése alatt olyan fúziós proteint képes exprimálni, amelyben az L’- és D'-peptid után az Ala-Ser-Met-Thr-Arg aminosavszekvencia következik, és ehhez a proinzulin aminosavszekvenciája csatlakozik. 2. példa A pH154/25 plazmidot (3. ábra) BamHI és XmalII restrikciós enzimekkel vágjuk, és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük, majd T4 DNS-ligázzal összekötjük. A pH254 plazmid (4. ábra) keletkezik, amely a trp-promotor ellenőrzése alatt L’.D’-proinzulin típusú aminosavszekvenciát tartalmazó fúziós protein expressziójára képes. A plazmid a pH154/25 plazmidnál valamennyivel kisebb, ami előnyös lehet. 3. példa A pH254 plazmidot (2. példa, 4. ábra) az Miül és Sáli restrikciós enzimekkel inkubálva 280 bázispáros szakaszt szabadítunk fel, majd eltávolítjuk. A maradék plazmidot Klenow-polimerázzal tompa végű formává alakítjuk, majd DNS-ligázzal újból kovalensen ciklizáljuk. A kapott pH255 plazmid (4. ábra) alkalmas arra, hogy szerkezeti gént vigyen a Miül, Sáli vagy EcoRI restrikciós helyekbe. Indukáló körülmények között L\D'-proteint tartalmazó fúziós protein képződik. Termé- 6 szetesen alkalmas linker alkalmazásával további restrikciós helyeken is bevihetünk a pH255 plazmidba. 4. példa A pH154/25 plazmidot (3. ábra) a Miül és EcoRI enzimekkel inkubáljuk, és a kivált DNS-fragmenést (mintegy 300 bp) eltávolítjuk. A maradék plazmidot Klenow-polimerázzal feltöltjük. DNS-ligázzal gyűrűzárást végzünk. A kapott pH256 plazmid (5. ábra) szerkezeti géneknek az EcoRI-helybe történő beviteléhez alkalmas. 5. példa A pH256 plazmidból (4. példa, 5. ábra) 600 bp-fragmenst távolítunk el a BamHI és Nrul enzimekkel, így kapjuk a pH257 plazmidot (5. ábra). A pH256 plazmidot először BainHI enzimmel inkubáljuk, majd Klenow-polimerázzal tompa végeket alakítunk ki. Nrul enzimmel végzett inkubálás és a 600 bp-fragmens eltávolítása után DNS-ligázzal inkubáljuk a plazmidot, így képződik a pH257 plazmid. 6. példa A pKK 177-3 plazmidba [Araann és mts-i, Gene 25 (1983) 167] a lac-represszort beépítve [P.J. Farabaugh, Nature 274 (1978) 765- 769] jutunk a pJF118 plazmidhoz. Ezt EcoRI és Sáli enzimekkel reagáltatjuk, és a maradék plazmidot izoláljuk. A pH 106/4 plazmidból (2. ábra) Sáli behatásával és Mtsl enzimmel végzett inkubálással mintegy 495 bázispáros fragmenst nyerünk. A szintetikusan előállított (N6) és (N7) képletű oligonukleotideket 5’ ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG 3’ (N6) 5’ CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3’ (N7) foszforilezzük és DNS-ligázzal a tompa végű DNS-fragmenshez addicionáltatjuk. Az EcoRI és Sáli enzimekkel végzett reagáltatás útján átlapoló végeket alakítunk ki, amelyekkel ligáim lehet a DNS-fragmenst a kinyitott pJF118 plazmidba. A kapott hibridplazmidot az E. coli 294 mikroorganizmusba transzformáljuk, majd a restrikciós fragmensek mérete alapján kiválasztjuk a kívánt kiónokat. A hibridplazmid (6. ábra) jele pJ120. A fúziós protein expresszióját rázólombikban végezzük az alábbiak szerint. A pJ120 plazmidot tartalmazó E. coli 294 transzformált egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) egy éjsza-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 £5 60 65
