197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
10 197356 11 kén át tenyésztett kultúrából mintegy 1:100 arányban új tenyészetet állítunk be, és a növekedést OD-méréssel figyeljük. OD=0,5 értéknél a tenyészethez annyi izopropil-ß-D- galaktropiranozidot (IPTG) adunk, hogy koncentrációja a közegben 1 mmól legyen. 150- -180 perc elteltével a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen át pufferoldatban (7 M karbamid, 0,1% SDS, 0,1 M nátrium-foszfát, pH 7,0) forraljuk, majd mintákat SDS-gél-elektroforézis lemezre viszünk. A pJ120 plazmidot tartalmazó baktériumok az elektroforézis során olyan proteinsávot adnak, amely a várt fúziós protein móltömegének megfelel és inzulin elleni antitestekkel reagál. A fúziós protein elkülönítése után brómciánnal fel lehet szabadítani a várt proinzulin-származékot. A baktériumok feltárása [French Press; (K)Dyno-malom] és centrifugálása után az L’-D’-proinzulin-fúziós protein a csapadékban van, így a felülúszó rész eltávolításával a többi proteinek zömét már elválasztjuk. A fenti körülmények rázott kultúrákra érvényesek; nagyobb fermentor esetén az OD-értéket megfelelően, adott esetben az IPTG-koncentrációt is enyhén meg kell változtatni. 7. példa A pH154/25 plazmidot (3. ábra) tartalmazó E. coli 294 transzformált egyedekből álló, 50 ug/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben egy éjszakán át tenyésztett kultúrát másnap mintegy 1:100 arányban 2000 jug/ml .Casamino acids' hidrolizátumot és 1 ng/ml tiamint tartalmazó M9-kőzeggel (J.H. Miller, a fent megadott helyen) hígítjuk. OD=0,5 értéknél annyi indolil-3-akrilsavat adunk a tenyészethez, hogy a koncentráció 15 ug/ml legyen. Két-há -rom óra inkubálás után a baktériumokat lecentrifugáljuk. Az SDS-gél-elektroforézis a fúziós protein várt helyén igen erős proteinsávot mutat, amely inzulin elleni antitestekkel reakciót ad. A baktériumok feltárása és centrifugálása után az L\D’-proinzulin-fúziós-protein a csapadékban van, így a felülúszó résszel együtt már a többi protein tetemes részét is eltávolítjuk. Ez esetben is a megadott indukciós körülmények rázott tenyészetre érvényesek. Nagyobb térfogatú fermentálás esetén a Casamido acids koncentráció változtatása, illetve L-triptofán hozzáadása szükséges. 8. példa A pH154/25 plazmidot (3. ábra) EcoRI enzimmel nyitjuk, és a túlnyúló DNS-szálakat Klenow-polimerázzal feltöltjük. Az így kapott DNS-t a Miül enzimmel inkubáljuk, és az inzulint kódoló DNS-részt a plazmidból kivágjuk. A kivágott részt gél-elektroforézissel elkülönítjük a maradék plazmidtól, és a maradék plazmidot izoláljuk. A 3 429 430 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat 3. ábráján ismertetett plazmidot az AccI és Sáli restrikciós enzimekkel reagáltatjuk és a hirudin-szekvenciát tartalmazó DNS- fragmenst elkülönítjük. A Sáli vágóhely túlnyúló végeit Klenow-polimerázzal feltöltjük, és a DNS-t a szintetikusan előállított (N8) képletül DNS-sel Met Thr 5’ CCG ACG CGT ATG ACG T 3’ (N8) 3’ GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5’ ligáljuk. A ligációs terméket Miül enzimmel inkubáljuk, majd az enzimet 65 °C-on inaktiváljuk, és a DNS elegyet 37 °C-on egy órán át alkálikusan marhafoszfatázzal kezeljük. Utána mind a foszfatázt, mind a restrikciós enzimet fenollal végzett extrahálás útján az elegyból eltávolítjuk és a DNS-t etanollal kicsapva tisztítjuk. Az így kezelt DNS-t T4-Ü- gázzal a pH154/25 nyitott maradék plazmidba illesztjük; így a 7. ábrán mutatott pK150 plazmidot kapjuk, amelyet restrikciós elemzéssel, valamint Maxam és Gilbert szerint végzett szekvencia-elemzéssel azonosítunk. 9. példa A pK150 plazmidot (7. ábra) tartalmazó E. coli 294 baktériumokat 30-50 ug/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztjük, másnap a tenyészetet mintegy 1:100 arányban 2000 ug/1 .Casamino Acids, hidrolizátumot és 1 yug/ml tiamint tartalmazó M9-közeggel hígítjuk és 37 °C-on állandó keverés közben inkubáljuk. OD«oo= =0,5, illetve 1 esetén indolil-3-akrilsavat adunk a tenyészethez 15 /ug/ml koncentráció eléréséig, majd 2-3 órán át, illetve 16 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Utána a baktériumokat lecentrifugáljuk és 0,1 M nátrium-foszfát-pufferben (pH 6,5) nyomás alatt feltárjuk. A nehezen oldódó proteineket leszűrjük, és SDS-poliakrilamid elektroforézissel azonosítjuk. Azok a sejtek, amelyekben a trp-operon beindult, 20 000 daltonnál kisebb, de 14 000 daltonnái nagyobb mólsúlyú új proteint tartalmaznak, amely a nem indukált (be nem indult) sejtekben nem található. A fúziós proteint elkülönítjük és brómciánnal a hiruöint felszabadítjuk. 10. példa Az alábbiakban olyan szerkezeteket mutatunk be, amelyekkel különböző restrikciós enzimek által felismerhető helyeket minél nagyobb számban tartalmazó DNS-szekvenciákat lehet beépíteni a trp-D-szekvencia 5'-vége elé. Az így módosított trp-D-szekvencia a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
