197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
2 197356 3 A találmány tárgya eljárás fehérjék vagy peptidek fúziós protein formán keresztül történő előállítására. Kisebb (mintegy 15 000 daltonig terjedő) móltőmegű eukarióta proteinek géntechnológiai előállításakor baktériumokban a hozam gyakran alacsony. Feltételezhető, hogy a gazdasejt saját proteáz enzimjei a képződött proteint hamar lebontják. Ezért az említett kisebb móltömegű proteineket célszerűen fúziós proteinként állítják elő, előnyösen olyan proteinrésszel, amely a gazdasejtó; ezt a részt később lehasitják. Azt találtuk, hogy az E. coli trp-operonjából származó D-proteinnek egy csupán mintegy 70 aminosavból álló szakasza különösen alkalmas fúziós proteinek képzéséhez, mégpedig a 23-tól 93-ig terjedő aminosavszekvencia tartományban [C. Yanofsky és mts-i, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 6647]. Ezt a részt az alábbiakban „D’-peptid '-nek is nevezzük. E. peptid karboxil-terminálisa és a kívánt eukarióta protein aminosavszekvenciája között egy vagy több genetikailag kódolható aminosavból álló olyan szekvencia helyezkedik el, amely lehetővé teszi a kívánt protein kémiai vagy enzimes lehasitását. A találmány szempontjából előnyös, ha az aminoterminálishoz a Lys-Ala aminosavszekvencia csatlakozik, amelyet adott esetben 1-10, előnyösen 1-3 további genetikailag kódolható aminosavból álló szekvencia, különösen előnyösen 2 aminosavból álló, legelőnyösebben a Lys-Gly szekvencia követ. A találmány tárgya tehát eljárás valamely célfehérje vagy -peptid géntechnikai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállításának megkönnyítésére. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy Met-Xn-D’-(Y)«-Z képletű aminosav szekvenciának megfelelő génszerkezetet - a képletben n jelentése 0 vagy 1 X jelentése 1-12 aminosav hosszúságú szekvencia, D’ jelentése az E. coli trp-operonjában előforduló D-peptid 23-93. aminosavának megfelelő 70 aminosav szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav kiiktatásával, hozzátoldásával vagy cseréjével megváltoztatott variánsa, Y jelentése 1-4 aminosavból álló hid, amely enzimesen vagy kémiai úton hasítható, illetve lehasitható, m jelentése 1, 2, 3 vagy 4 és Z jelentése a célfehérje vagy -peptid szekvenciája - megfelelő vektorba építünk, a vektort E. coli sejtbe transzformáljuk, a transzformált törzset megfelelő közegben tenyésztjük, a tenyészléből vagy a sejtekből a fúziós fehérjét izoláljuk, és a fúziós fehérjét az Y jelű hídnál hasítva a célfehérjét vagy -peptidet kinyerjük. Természetesen előnyös, ha a fúziós protein nemkívánatos (a gazdasejt proteinjéből álló) része minél kisebb, mert ez esetben a sejt kevesebb .csomagolást" termel, és Így a kívánt protein hozama nagyobb. Ezen kívül a nem kívánt rész lehasitásakor kevesebb melléktermék képződik, ami a feldolgozást megkönnyíti. Ezzel ellentétben áll, hogy a nem kívánt rész (feltételezett) .védőfunkciója" csak egy bizonyos nagyságrend felett várható. Meglepő módon megállapítást nyert, hogy a D-proteinből a találmány szerint kiválasztott. szegmens az említett funkciót ellátja, pedig csak mintegy 70 aminosavból áll. Számos esetben - főleg az előnyben részesített kiviteli alak esetén, ahol X jelentése Lys-Ala vagy N-terminálisán ezt a szekvenciát tartalmazza - oldhatatlan fúziós protein keletkezik, amelyet egyszerűen lehet elválasztani az oldódó proteinek mellől, így a feldolgozás egyszerű és a hozam magas. Az oldhatatlan proteinek képződése meglepő, mert egyrészt a mintegy 70 aminosavból álló bakteriális rész eléggé jelentéktelen, másrészt ez a szakasz része egy olyan proteinnek, amely a gazdasejtben oldott állapotban van jelen. .A D-peptid 23-tól 93-ig terjedő aminosav-szekvenciájának 70 aminosava vagy annak variánsa" kifejezéssel azt kívánjuk érzékeltetni, hogy ismert módon variációk lehetségesek, azaz egyes aminosavak elhagyhatók, pótolhatók vagy kicserélhetók anélkül, hogy emiatt a találmány szerint előállítható fúziós proteinek tulajdonságai szignifikánsan változnának. Az ilyen variációk szintén a találmány tárgykörébe esnek. A kívánt eukarióta protein előnyösen biológiailag aktív protein, például hirudin típusú protein vagy olyan protein előterméke, mint például a humán proinzulin. A fúziós E. coli-ban végzett expresszióval nyerjük és előnyösen a gazdasejtek feltárása után a csapadékban izoláljuk, ahol- oldhatatlan anyag lévén - feldúsul. A proteint tehát könnyen elválaszthatjuk a sejt oldódó alkotóitól. Előnyösen a x-fág Lac, Tac, Pi vagy Ps csoportjából választunk promotort és operátort, alkalmasak hsp, omp vagy szintetikus promotorok is, amelyeket a 3 430 683 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat (0 173 149 sz. európai szabadalmi bejelentés) ismertet. Különösen alkalmas olyan vektor, amely az E. coli trp-operonjából az alábbi elemeket tartalmazza: a promotort, az operátort és az L-peptid riboszóma-kötését. A kódoló tartományban előnyösen ennek az L-peptidnek az első három aminosava következik, és ehhez- rövid aminosavszekvencián keresztül - a trp-operon D-proteinjének 29-93. aminosava csatlakozik. A kívánt polipeptid lehasitását lehetővé tevő Y jelű közbenső szekvencia a kívánt peptid összetételétől függ: amennyiben ez a peptid nem tartalmaz metionint, Y helyén Met állhat, és brómciánnal végzett kémiai hasítás 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
