197356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérjék vagy peptidek géntechnológiai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállítására
4 197.156 5 lehetséges. Ha az Y jelű közbenső tag a karboxilterminálisan ciszteint tartalmaz, vagy Y jelentése Cys, cisztein-specifikus enzimmel vagy kémiailag, például előzetesen végzett specifikus S-cianilezés után lehet hasítani. Amennyiben az Y jelű áthidaló tag a karboxilterminálisan triptofánt tartalmaz, vagy Y jelentése Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukcinimiddel lehetséges. Y=Asp-Pro esetén a hasítást ismert módon [D. Piszkiewicz és mts-i, Biochemical and Biophysical Research Communications 40, (1970), 1173-1178] proteolitikusan végezhetjük. Az Asp-Pro-kötést, úgy találtuk, még jobban savérzékennyé lehet tenni, ha Y jelentése (Asp).-Pro, illetve Glu-(Asp)»-Pro (ahol m jelentése 1, vagy 2 vagy 3). Olyan hasítási termékek keletkeznek, amelyek N-terminálisan Pro-val kezdődnek, illetve C-terminálisan Asp-vel végződnek. Enzimes hasításra is ismertek példák, és módosított, azaz javított specifitású enzimek alkalmazása is lehetéges [C. S. Craik és mts-i, Science 228 (1985), 291-297]. Ha kívánt eukarióta peptidként humán proinzulint akarunk nyerni, az Y jelű szekvenciaként olyan peptidszekvenciát választhatunk, amely a proinzulin N-terminális aminosavához (Phe) kapcsolódó, tripszinnel lehasitható aminosavat (Arg, Lys) tartalmaz, Így Y lehet például Ala-Ser-Met-Thr-Arg, és az arginin-specifikus hasítást tripszin proteázzal lehet végezni. Amennyiben a kívánt proteinben az Ile-Glu-Gly-Arg aminosavszekvencia nem szerepel, a hasítás az Xa faktorral is végezhető (0 161 937 sz. európai szabadalmi bejelentés). Az Y jelű szekvencia kialakításakor a szintézis körülményeire is tekintettel lehetünk, például restrikciós enzimek számára alkalmas vágóhelyeket építhetünk be. így az Y jelű aminosavsorozatnak megfelelő DNS-szekvencia linker vagy adapter funkciót is teljesíthet. A találmány szerint előállítható fúziós proteint előnyösen az E. coli trp-operonjának ellenőrzése alatt exprimáljuk. A trp-operon promotorát és operátorát tartalmazó DNS-szakasz már kereskedelmi termék. A trp-operon ellenőrzése alatt végzett protein-expressziót már számos helyen leírták (0 036 776 sz. európai szabadalmi leírás). A trp-operon beindulását L-triptofán hiánya és/vagy indolil-3-akrilsav jelenléte segítségével érhetjük el. A trp-operétor ellenőrzése alatt először a 14 aminosavból álló L-peptid íródik át. Az L-peptid 10. és 11. helyén L-triptofán van. Az L-peptid proteinszintézisének sebessége határozza meg azt, hogy a következő szerkezeti gének szintén forditódnak-e, vagy a proteinszintézis megáll-e. Amennyiben kevés a közeg az L-triptofán, az L-peptid csak lassan szintetizálódik, mert az L-triptofános tRNS koncentrációja kicsi, így a következő proteinek szintézise halad. Nagy L-triptofán- 4-koncentráció esetén viszont a küldönc (messenger) RNS megfelelő szakasza gyorsan leolvasódik, és a protein bioszintézise megszakad, mert a küldönc RNS terminálisszerü szerkezetet vesz fel (C. Yanofsky és nits-í, a fent megadott helyen). A küldönc RNS transzlációjának gyakorisága erősen az indító kodon (startkodon) környezetében fellelhető nukleotidek milyenségétől függ. Fúziós protein trp-operon segítségével végzett expressziója esetén ezért előnyösnek tűnik, ha a fúziós protein szerkezeti génjének az elejét az L-peptid első aminosavainak a nukleotidjei alkotják. A találmány előnyös megvalósítása során a trp-rendszerben az L-peptid első három aminosavának (az alábbiakban L’-peptid) nukleotidjeit választottuk a fúziós protein N-terminális aminosavainak kodonjaiként. A fentiek értelmében a találmány fúziós proteinek expressziójához alkalmas vektorokra, előnyösen plazmidokra is kiterjed, ahol a vektorok DNS-a az 5’-végtől sorolva (alkalmas -elrendezésben és fázisban) az alábbiakkal rendelkezik: egy promotor, egy operátor, egy riboszóma-kötóhely és a fúziós protein szerkezeti génje, és a fúziós protein a kívánt protein szekvenciája előtt az I. képletú aminosavszekvenciát (lásd mellékletek) tartalmazza. A szerkezeti gén előtt, illetve annak első triplettjeként az indító kodon (ATG) és adott esetben aminosavakat kódoló további kodonok helyezkednek el, az indító kodon és a D’-szekvencía vagy a D’-szekvencia és a kívánt protein génje között. A kívánt protein aminosav-összetételétől függően választjuk a szerkezeti gén előtti DNS-szekvenciát, olyat, amely a kívánt protein lehasitását lehetővé teszi. A fúziós protein expressziója során célszerű lehet, ha az ATG indító kodont kővető első aminosavak egyes triplettjeit megváltoztatjuk, hogy a küldönc RNS szintjén esetleg bekövetkező bázis-párképzödést megakadályozzuk. Az ilyen módosítások, mint ahogy a D’-protein egyes aminosavainak megváltoztatása, kihagyása vagy hozzáadása is szakember számára ismert műveletek, és a találmány ezekre is kiterjed. Tekintettel arra, hogy a kisebb plazmidoknak több előnye is van, a találmány egy előnyös megvalósítása során a pBR 322 plazmádtól le származtatott plazmidokból a tetraciklin elleni rezisztenciát előidéző szerkezeti gént tartalmazó szakaszt eltávolitjuk. Előnyös, ha a 29. helyen lévő HindlII-vágóhely és a 2066. helyen lévő PvuII-vágóhely közötti szekvenciát távolítjuk el. Különösen előnyős, ha a találmány szerinti plazmidokból még a fentinél valamennyivel nagyobb DNS-szakaszt távolítunk el a trp-operon (leolvasási irányban nézve) elején lévő PvuII-vágóhely felhasználásával (ez a vágóhely nem-esszenciális részben helyezkedik el). Ezúton a keletkező nagy fragmenst közvetlenül a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
