197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
16 197354 17 B. ) A pIJ702 plazmid emésztése Pst I-el Mintegy 1 pg (10 pl), & 2. példa szerint izolált pIJ702 plazmidot összekeverünk 5 pl 10-szeres Pst I pufferral, 2 pl (kb. 10 egység) Pst I restrikciós enzimmel és 33 pl H2O-val, majd reagáltatunk 37 °C hőmérsékleten két órán át. A reakciót 65 °C hőmérsékleten 10 percen át történő melegítéssel állítjuk le, és a Pst I-el emésztett DNS-t ez után -20 °C hőmérsékleten tároljuk. C. ) A fragmensek ligélása a pSVB16 és pSVB18 plazmidok képzésére 5 pl, a 4 A.) példa szerint izolált, mintegy 3,8 kb-s, a tilozin-rezisztencia génjét tartalmazó Pst I restrikciós fragmenst és 25 pl, a 4 B.) példa szerint izolált, Pst I-el emésztett pIJ?02 plazmidot ligálunk lényegében a 3 C.) példában megadott kitanítással összhangban. A ligáit DNS-el alkotják a kívánt pSVB16 és pSVB18 plazmidokat. A plazmidok csupán a mintegy 3,8 kb-s Pst I restrikciós fragmens orientációja szempontjából különböznek (lásd az 5.) és 6.) ábrákat). 5. példa A pSVB20 és pSVB22 plazmidok megalkotása A.) A pSVB2 plazmid BamHI és BglII emésztése és a mintegy 2,9 kb-s BamHl-BglII fragmens izolálása Mintegy 50 pg, az 1. példa szerint izolált pSVB2 plazmidot összekeverünk 10 pl 10- -Bzeres BamHI-BgRI pufferral*, 5 pl (kb. 50 egység) BamHI restrikciós enzimmel, 5 pl (kb 50 egység) Bgl II restrikciós enzimmel és 30 pl HíO-val, és 37 °C hőmérsékleten reagáltatunk két óra hosszat. Hő-inaktiválás után a kívánt, a tilozin-rezisztencia gént tartalmazó, mintegy 2,9 kb-s BamHI-BGRI restrikciós fragmenst megtisztítjuk lényegében Maniatis és munkatársainak kitanitásával összhangban (1982), és a nyert mintegy 10 pg tisztított fragmenst 100 pl TE pufferban szuszpendáljuk és 4 °C hőmérsékleten tároljuk. B. A pIJ702 plazmid Bgl II emésztése Mintegy 1 pg (10 pl), a 2. példa szerint előállított pIJ702 plazmid DNS-t összekeve- 5 rünk 5 pl 10-szeres Bgl II pufferral*, 2 pl (20 egység) Bgl II restrikciós enzimmel és 33 pl H20-val, és 37 °C hőmérsékleten két órán ét reagáltatunk. A reakció 65 °C hőmérsékleten, 10 percen át végzett inaktiválása 10 után a Bgl II-vel emésztett plazmid DNS-t -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A 10-szeres Bgl II puffer összetétele a következő: 15 1 mól/liter NaCl 100 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,4 100 mmól/liter MgClz 100 mmól/liter 2-merkapto-etanol 1 mg/ml BSA 20 *-----------------------------------------------------------'------------C. A fragmensek lig&lása a pSVB20 és pSVB22 képzésére 25 5 pl, az 5 A.) példa szerint készített, a tilozin-rezisztencia-átvivő gént tartalmazó mintegy 2,9 kb-s BanMI-BgRI restrikciós fragmenst összekeverünk 25 pl, az 5 B.) példa szerint készített, Bgíl-vel emésztett 30 pIJ702 plazmiddal, majd ligálunk lényegében a 3 C.) példában megadott kitanitással összhangban. A ligáit DNS-el alkotják a kívánt pSVB20 és pSVB22 plazmidokat (lásd 7.) és 8.) ábrák). Meg kell jegyezni, hogy amikor 35 egy Bandii és BgTLl helyet ligálunk együtt, egy XhoII felismerő szekvencia képződik. A pSVB20 és pSVB22 plazmidok csupán a beiktatott mintegy 2,9 kb-s BamHI-BgEI restrikciós fragmens orientációja szempontjából kü- 40 lönböznek. 6. példa 45 Tilozin-rezisztens Streptomyces griseofuscus transzformánsok megalkotása A. Az oldatok és tápközegek listája 50 A következő oldatokra és tápközegekre hivatkozunk a 6.) és 7.) példák során, amelyek összetételét az alábbiakban tisztázzuk: * A 10-szeres BamHI- BgRI puffer összetétele a következő: 55 1,25 mól/liter NaCl 80 mmól/liter Trisz-HCl, pH 7,7 80 mmól/liter MgCh 100 mmól/liter 2-merkapto-etanol 1 mg/ml BSA 60 1.) P tápkőzeg (mintegy 100 ml) Alkotórész S zacharóz K?SO< N yomelem-oldat (lásd 3. tétel) MgCk.6H20 Viz Mennyiség 10.3 g 0.025 g 0.2 ml 0.203 g 80 ml-ig 10
