197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
18 197354 19 Autoklávozás utón hozzáadunk: KHzPO« (0.5X-OS) 1 ml CaCl2.2HíO (3.68X-os) 10 ml N-triaz- ( hidroxi-metil )- metil-2-amino-etánszulf onsav (.TES’ puffer, 0.25 mól/liter, pH 7.2) 10 ml Az összes alkotórészt autoklávozással sterilezzük. A folyékony komponenseket öszszekeverjük, majd hozzáadjuk a megfelelő mennyiségű olvadt polietilénglikolhoz. Az első 5 négy alkotórészt előre össze lehet keverni és szobahőmérsékleten lehet tárolni legalább egy hónapon át. 2. L tápkőzeg (mintegy 100 ml) Alkotórész Szacharóz (10.3X-os) .TES’ puffer (pH 7.2, 0.25 mól/liter) K2SO4 (2.5X-os) Nyomelem-oldat (lásd 3. tétel) KH2PO4 (0.5%-os) MgCb (2.5 mól/literes) CaCb (0.25 mól/literes) lizozim Az L tápkőzeget szűréssel elkészítés után Mennyiség 100 ml 10 ml 1 ml 0.2 ml 1 ml 0.1 ml 1 ml 1 mg/ml sterilezzük 10 15 20 3.) Nyomelem oldat (kb. 1 liter) 25 Alkotórész ZnCb FeCb.6H20 CuCb.2H20 MnCb.4H20 Na2B*Oi.l0H2O (NH*)sMo?Oz4.4H2O Mennyiség 40 mg 200 mg 10 mg 30 10 mg 10 mg 10 mg 4.) R2 regeneráló tápkőzeg (kb. 1 liter) 35 Alkotórész Szacharóz K2SO4 Nyomelem-oldat MgCb.6H20 glükóz L-aszparagin. IH2O .casamino acid" (tejfehér je-hidrolizátum) agar víz Autoklávozás után hozzáadunk: KH2PO4 (0.05 g/100 ml) CaCb (2.22 g/100 ml) .TES’ puffer (5.73 g/ ' /ÍOO ml, pH 7,2) NaOH (5 n) Mennyiség 103 g 0.25 g 2 ml 10.12 g 10 g 2.0 g 0.1 g 22 g 700 ml-ig 100 ml 100 ml 100 ml 1 ml 40 45 50 5.) T tápközeg (mintegy 14.5 ml) Alkotórész Szacharóz (10.3X-os) Desztillált víz Nyomelem-oldat K2SO4 (2.5X-OS) CaCb (5 mól/literes) Trisz-maleinsav, pH 8, (1 mól/literes) Polietilénglikol 1000 Mennyiség 2.5 ml 7.5 ml 20 M1 100 ni 217 ni 543 M1 3.63 g 55 60 65 6. ) Lágy tápagar (SNA, mintegy 1 liter) Alkotórész Mennyiség Difco Bacto Nutrient Broth 8 g Agar 5 g 7. ) R2YE tápközeg: R2 tápkőzeg, amelyhez literenként 20 ml 25%-os élesztőkivonatot adunk. 8.) Élesztőkivonat-Malátakivonat (YEME, mintegy 1 liter) Alkotórész Élesztőkivonat Pepton Malátakivonat Glükóz Mennyiség 3 g 5 g 3 g 10 g 9.) YEME+34% Szacharóz Folyékony Komplett Tápközeg: YEME 340 g/liter szacharózzal kiegészítve Alkotórész Élesztőkivonat Maiátakivonat Glükóz Agár Mennyiség 3 g 3 g 2 g 20 g B. A tenyészetek növesztése protoplaszt készítéséhez Hagyományos módon vegetativ inokulumot készítünk, Streptomyces griseofuscus C581-et (ATCC 23 916) süllyesztett körülmények között növesztve 20 órán át 30 °C hőmérsékleten 0,4X glicinnel kiegészített TSB-ben. A S. griseofuscus protoplaszkészitési eljárását általában az alábbiak szerint hajtjuk végre. S. griseofuscus tenyészetet szélesztünk egy YMX agart (0,3X élesztőkivonat, 0,3% malátakivonat, 0,2% glükóz és 2X agar) tartalmazó lemezen, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk mintegy 48 órán át. Az egyedi baktérium-telepet inokulálunk azután a lemezről 10 ml TSB-be; a tenyészetet homogenizáljuk, majd 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. Az egy éjszakán át nőtt tenyészet mintegy 4 ml-ét homogenizáljuk, hozzáadjuk 100 ml, 0,4X glicinnel kiegészített TSB-hez, majd egy éjszakán át inkubáijuk 30 °C hőmérékleten. Ezt az eljárást megismételjük, a friss, egy éjszakán át nőtt tenyészetet alkalmazva. Ezután mintegy 50 ml 50%-os (térf./térf.) glicerint adunk a tenyészethez és 15 ml-es mintákat fagyasztunk és tárolunk (akár hat hónapig is) -20 °C hó-11
