197353. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban szintetikus regulációs terület segítségével
4 197353 5 nukleotidpárt, amelyek a restrikciós enzimek számára a megfelelő vágás megkezdését lehetővé teszik. A lia DNS-szekvenciát emellett teljesen megadtuk, itt az 5’- és 3’-végeken 3-3 nukleotidpár hozzá van illesztve. Itt természetesen más, illetve több nukleotidpár is hozzá lehetne csatolva. A következő példákban a találmány szerinti eljárás speciális kiviteli módjait mutatjuk be, amiből szakember számára a változatok és kombinációk sokasága nyilvánvaló. A százalékos értékek tömegszázalékot jelölnek, hacsak nincs másképpen mégjelölve. 1. példa A Ha DNS-szekvencia szintézise a) Egy egyszálú oligonukleotid kémiai szintézise A kódoló ág 1-19 nukleotidjait (és további hármat az 5’-végen a Bam Hl vágás megkezdésének lehetővé tételére) tartalmazó la gén-épitőelem példáján bemutatjuk a gén-épitőelemek szintézisét. A 3’-végen álló nukleozidot, jelen esetben tehát a timidint (19. sz. nukleotid) ismert módszerekkel [M.J.Gait és munkatársai, Nucleic Acids Res. 8, 1081-1096 (1980)3 szilikagélen (FRACTOSIL, Merck gyártmány) a 2'-hidroxil-csoportokon keresztül kovalensen megkötjük. Ehhez a szilikagélt először etanol lehasitása közben 3-(trietoxi-szilil)-propil-aminnal kezeljük, melynek során a Si-O-Si-kötések kialakulnak. A timidint paranitro-fenol és N,N’-diciklohexil-karbodiimid jelenlétében a módosított hordozóval kezeljük, melynek során a szukcinoilcsoport szabad karboxilcsoportja a propilamin-csoport aminocsoportját acilezi. A kővetkező szintézislépésben a báziskomponenst 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-fo8zforossav-monoetil-észter-dialkil-amid vagy -klorid formájában alkalmazzuk, melynek során az adenin N^-benzoil-származék, a citozin N^benzoil-származék, a guanin N2- -izobutiril-származék és az aminocsoportot nem tartalmazó timidin védöcsoport nélkül van jelen. 100 mg polimer hordozót, amely 4 /uniói timidint tartalmaz megkötve, egymás után a következő szerekkel kezelünk: a) nitrometán, b) IX vizet tartalmazó teli tett cink-bromid-oldat nitrometánban, c) metanol, d) tetrahidrofurán, e) acetonitril, f) 80 jjmól megfelelő nukleozid-foszfit és 400 /umól tetrazol 1 ml vízmentes acetonitrilben (5 perc), g) 20X acetanhidrid tetrahidrofuránban 40X lutidinnel és 10X dimetil-amino-piridinnel (2 perc), h) tetrahidrofurán, i) tetrahidrofurán 20% vízzel és 40X lutidinnel, j) 3% jód kollidin - viz - tetrahidrofurán 5:4:1 térfogatarányú elegyében. k) tetrahidrofurán és l) metanol. A .foszfif kifejezésen a dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monoetil-észter értendő, ahol a harmadik vegyértéket klór vagy egy tercier aminocsoport, például morfolinocsoport köti le. Az egyes szintézislépések kitermelését a b) detritilezési reakció után spektrofotometriásán a dimetoxi-tritil-kation 496 nm hullámhosszon mért abszorpciójával lehet meghatározni. Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metil-foszfát-védőcsoportjait p-tiokrezol és trietil-amin segítségével hasítjuk le. Végül az oligonukleotidot a szilárd hordozóról 3 óra hosszat tartó aramóniás kezeléssel választjuk le. Az oligomer koncentrált ammóniával végzett 2-3 napos kezelése az aminovédőcsoportokat a bázisról teljesen lehasitja. Az igy kapott nyers terméket nagynyomású folyadék kromatográfiával (HPLC) vagy poliakrilamidgél-elektroforézissel tisztítjuk. Az Ib-Ih építőelemeket egészen hasonló módon szintetizáljuk, amelyeknek a nukleotid sorrendje a Ha DNS-szekvenciából következik. b) Az egyszálú oligonukleotidok enzimatikus kapcsolása Az oligonukleotidok 5’-végi foszforilezéséhez 1,0 nmól Ib és Ic oligonukleotidot 10 nmól adenozin-trifoszfát adagolása mellett 6 egység T4-polinukleotid-kináz 20 /ul 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferrel (pH=7,6) készült oldatával, amely 10 mmól/1 magnézium-kloridot és 10 mmól/1 ditiotreitolt (DTT) tartalmaz 30 percig 37 °C-on kezeljük [C.C. Richardson, Progress in Nucl. Acid Res. 2, 825 (1972)]. Az enzimet 95 °C-on 5 percig tartó kezeléssel dezaktiváljuk. Az If és lg oligonukleotidokat hasonló módon foszforilezzük. Az la és Id oligonukleotidokat és a foszforilezett Ib és Ic oligonukleotidokat 40 /ul 50 mmól/l-es Tris-HCl-pufferben 5 percig 95 °C-on melegítjük, majd lassan szobahőmérsékletre lehűtjük. Ehhez az elegyhez hozzáadunk 20 mmól magnézium-kloridot, 10 mmól DTT-t és 1 mmól ATP-t, és 100 egység T4-DNS-ligázzal 25 °C-on 16 óra hosszat reagáltatjuk. Hasonlóképpen kapcsoljuk az le és Ih fragmenseket a foszforilezett If és lg fragmensekkel. Az Ia-Id (A génfragmens) oligonukleotidok ligázreakciójának termékeit fagyasztva szárítjuk, és 100 /ul pufferoldatban (150 mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 Tris-HCl, pH=7,6, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
