197353. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban szintetikus regulációs terület segítségével
6 197353 7 6 mmól/1 magnézium-klorid), amely 200 egység Bam Hl endonukleázt tartalmaz, 37 °C-on 3 óra hosszat inkubáljuk. Az Ie-Ih oligonukleotidok (B génfragmens) ligázreakciójának termékeit fagyasztva szárítjuk, és .100 pl pufferoldatban (100 mmól/1 Tris-HCl, pH=7,5, 50 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 magnézium-klorid), amely 200 egység Eco Rí endonukleázt tartalmaz, 37 °C-on 3 óra hosszat inkubáljuk. Az enzimreakció 95 °C-on 2 percig tartó hókezeléssel végzett leállítása után az A és B vágott génfragmenseket gélelektroforézissel 15%-os poliakrilamidgélen (karbamid adagolása nélkül, 20x x40 cm, 2 mm vastag) tisztítjuk, ahol markeranyagként Hae III-mal vágott pBR 322-t (Fa. Biolabs) használunk. A DNS-foltok extrakciója és Sephadex G50-en és Sep Pak-on (Fa. Waters) végzett tisztítás után az A és B génfragmenseket .tompa vég ligálással’ kapcsoljuk. Ilyen módon szintetikus, lia DNS-szekvenciának megfelelő regulációs területet kapunk, amely a kódoló ág 5’-végén a Bam Hl számára és a 3’-végen az Eco Rí számára tartalmaz toldalékban támadási helyet. 2. példa A szintetikus kontroll-területet tartalmazó hibridplazraidok a) A kontroll-terület beépítése pUC 8-ba A forgalomban levő pUC 8 plazmidot Eco Rí és Bam Hl restrikciós endonukleázokkal ismert módon megnyitjuk, és 1%-os alacsony olvadásponté agaróz-gélen a kivágott oligonukleotidoktól elválasztjuk. A vágott plazmid visszanyerését a gél felmelegítéssel végzett feloldásával végezzük, az előállító előírásai szerint. Az igy megnyitott pUC 8 plazmidból 1 jug-ot 10 jug szintetikus kontroli-területtel T4-DNS-ligáz segítségével 14 °C-on egy éjszakán át ligáljuk. Ilyen módon módosított, beépített kontroli-területtel rendelkező pUC 8 plazmidot kapunk. Ezt a hibridplazmidot az 1. ábrán mutatjuk be, ahol a kontrollterületet .SÍP' jelzés jelöli, (jelentése: synthetischer idealisierter Promotor). b) Transzformáció E. coli K 12 törzset 70 mmól/l-es kalcium-klorid-oldattal történő kezeléssel kompetenssé teszünk, és a hibridplazmid 10 mmól/ /1-es Tris-HCl-pufferrel (pH=7,5) készült szuszpenziójával, amely 70 mmól/1 kalcium-kloridot tartalmaz, kezeljük. A transzformált törzseket ampicillinrezisztencia alapján szelektáljuk, és a beépített szekvenciát Maxam-Gilbert féle szekvenciameghatározásBal [A.Maxam és W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 560-564 (1977)] igazoljuk. 3. példa A szintetikus kontroli-területet tartalmazó expressziós plazmidok A forgalomban levő pBR 322 plazmidot Bam Hl és Sal I restrikciós enzimekkel megnyitjuk, és a fent leirt módon 1%-os agarózgélen tisztítjuk. A szintetikus kontrollterületet a módosított pUC 8-ból Eco Rí és Bam Hl enzimekkel végzett vágás után visszanyerjük, 10%-os poliakrilamid gélen tisztítjuk, és végül elektroelúcióval visszanyerjük. Hasonló módon izoláljuk a ^-interferon-gént a megfelelő hibridplazmidokból Eco Rí és Sal I enzimes vágással, 2%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen végzett tisztítással, ^-interferont tartalmazó hibridplazmidként pMX 2 plazmidot alkalmazunk, amelynek előállítását a P 3 409 966.2 számú NSZK sztabadalmi leírás írja le. Alkalmazhatjuk azonban a 0 095 350 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett plazmidot is. A linearizált pBR 322 plazmidot, amely szintetikus kontrollterületet és ^-interferon-gént tartalmaz, ismert módon ligáljuk,-így a 2. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk. 4. példa A szintetikus kontrollterület és az ismert erős tac-kontrollterület aktivitásának összehasonlítása Az ismert pKK 177.3 plazmidot [E.Amann és munkatársai, Gene 25, 167 (1983)] Eco RI és Sal I restrikciós enzimekkel a fent leírt módon vágjuk és a ^-interferon-gént beépítjük, így ez a tac-kontrollterülethez kapcsolódik. igy a 3. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk. A pKK 177.3 plazmidból a tac-kontrollterület eltávolítására Bam Hl és Sal I emésztést végzünk. Az így linearizált plazmidot a fent leírt módon ^-interferon-génnel és szintetikus kontrollterülettel ligáljuk. igy a 4. ábrán bemutatott plazmidot kapjuk. A 3. és 4. ábra szerinti hibridplazmidot E. coli K 12-be transzformáljuk, és a baktériumot 2 Yt-tápközegen [Miller, Experiments in Molecular Genetics (1972)] tenyésztjük, míg a rázatott kultúra 578 nm-en mért 1 optikai sűrűségét el nem érjük. A baktériumtenyészet egy részéhez 0,1 mmól IPTG-t (izopropil-tiogalakto-piranozid) adunk, igy a -j-interferon szintézisét 2 óra hosszat indukáljuk. Végül a baktériumokat lecentrifugáljuk, és lizozimmal, EDTA-val és ultrahangos kezeléssel feltárjuk [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, (1982)]. A baktériumlizátum interferon-titerét a kö5 10 1.5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
