197353. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban szintetikus regulációs terület segítségével
2 197353 3 A találmány tárgya eljárás heterológ gének kifejezésének megkönnyítésére E. coliban szintetikus regulációs terület segítségével. Eukariotikus polipeptidek baktériumokban, különösen E. coliban történő géntechnológiai előállításakor a .heterológ' gént, amely a kívánt eukariotikus polipeptidet kódolja, egy alkalmas vektorba építik be, és ezt a hibridvektort egy baktérium gazdaszervezetbe viszik be. Egy sor feltételnek teljesülnie kell azonban ahhoz, hogy a heterológ gén a kívánt polipeptid termelését kiváltsa. Az egyik alapvető feltétel egy funkcionáló regulátor terület megléte, amely operátorból, promoter ból és úgynevezett .Shine-Dalgarno-szekvenciá'-ból áll. Ez utóbbi SD-szekvenciának vagy leegyszerűsítve a továbbiakban .riboszóma-kötőhely '-nek is nevezzük, mivel a riboszómán először az raRNS megfelelő szekvenciája kötődik meg. A gén helyes kifejeződésének, tehát a kívánt polipeptid termelésének feltétele, hogy a baktérium gazdaszervezet a promotort felismerje. A gazdaszervezetben levő RNS-polimeráz enzim felismeri a promoter DNS-ben levő részszekvenciáját és erre a részszekvenciára kötődik. Ezáltal ezen a területen a kettős szálú DNS felnyílása következik be, és így az mRNS szintézise a kódoló ágon (transzkripciós ág) elkezdődik. Az operátort, amely általában a promotorral átfedésben van, egy, a gazdaszervezetben levő represszor-protein ismeri fel. Ennek a represszor-proteinnek a többé vagy kevésbé hatékony kötődése az operátorra szabályozza a transzkripció gyakoriságát. Ezt a rendszert induktorok (indukáló molekulák) befolyásolják, amelyek a represszor-proteinhez kötődnek és Így az operátort aktiválják. A riboszóma kötőhelyek végül azért felelősek, hogy az mRNS legközelebbi szintetizált része olyan RNS-szekvenciával rendelkezzen, amely a riboszómára való kötődést biztosítja, ahol a transzláció, azaz a polipeptiddé való .lefordítás* folyik. így tehát a regulációs terület illetékes a génnek a transzkripció (DNS átírása raRNS-sé) és az azt követő transzláció fokozatain át történő expressziójában. Az ilyen regulációs terület felépítésében a nukleotidok sorrendjén kívül fontos a geometria, tehát a promoter, operátor és riboszóma-kötőhely térbeli elhelyezkedése. A következőkben a nukleotidok számozása a transzkripció kezdetének (nulla) helyéről indul, és a szokásos módon az 5’-től a 3’-irányban folytatódik. Az E. coli-RNS-polimeráznak megfelelő természetes promotorok két konzervált DNS-szekvenciával rendelkező területet tartalmaznak. Ez egyrészt a -35-terület, másrészt a -10-terület, amely .Pribnow-Schaller-Box' néven is emlegetnek, ahol a számmegjelölés az illető nukleotid-számozására vonatkozik, azaz ezek a területek a transzkripció-start előtt helyezkednek el. A találmány szerinti eljárásban egy szintetikus úton nyert regulációs szekvenciát alkalmazunk, amely a természetes regulációs szekvencia módosítása útján nyerhető, és amely biztosítja a promotoron az RNS-polimeráz optimális kötődését és az operátor effektiv kihasználását. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs szekvenciát vagy közvetlenül a heterológ gén elé helyezzük, melynek hatására a kívánt polipeptid (metioninnal az aminoterminálison) kiválasztódik, vagy a heterológ gén elé részben vagy teljesen egy baktériumgént kapcsolunk, miáltal egy fúziós protein választódik ki, és igy a kívánt protein aminoterminálisához egy baktérium-proteinrész van kapcsolva. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott promotort, módosított lac-operátort és riboszóma kötőhelyet tartalmazó, E. coli-ban heterológ gének expressziójáért felelős szintetikus regulációs terület a kővetkezőkkel jellemezhető: a) a -35-terület a promotorban a következő nukleotid-szekvenciával rendelkezik (kódoló ág): TTGACA, és kívánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén, b) a -10-terület a promotorban a következő nukleotid-szekvenciával rendelkezik (kódoló ág): TATAAT, és kívánt esetben még egy vagy két nukleotid ennek a szekvenciának bármelyik végén, c) a -35- és -10-terület között 14-17 bázispárból álló térköz-csoport van, és d) a riboszóma kötőhely és az ATG-startkodon között egy 6-14 bázispárból álló térköz-csoport van. Az előbb említett előnyökön kívül a találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs terület további előnye az, hogy nagyon jól variálható, és egy sor szinguler restrikciós vágóhely alapján az egyes elemek, nevezetesen a promoter, operátor és riboszóma kötőhely kivágható és ismert módszerekkel kombinálható. Továbbá, a térköz-csoport módosításával a geometria is variálható, és az egyedi eset adottságaihoz még jobban igazítható. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott regulációs terület előállítása előnyösen teljesen szintetikus úton történhet, a jól ismert DNS-szintézis módszerekkel, például a foszfitmódszerrel. Az I. DNS-szekvencia (1. melléklet) a teljes regulációs terület egy előnyös kiviteli alakja. A Ila-IIh DNS-szekvenciák az I. szekvencia specifikus, előnyös kiviteli alakjai. Az 1., illetve II. szekvencia szintéziséhez az 5’- és 3’-végekre mindig rákapcsolunk néhány 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
