197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
6 197352 7 rezisztencia átadó DNS szegmensei lehetnek pl. a mintegy 3,5 kb-s Pst restrikciós fragmens és a mintegy 3,4 kb-s J3amHI restrikciós fragmens nagyobbik SacII-JTpnl fragmensei is. Még más DNS szegmensek is alkothatok és alkalmazhatók, amelyek rezisztenciát adnak át azonos vagy különböző antibiotikumokra, mint pl. klóramfenikolra, higromicinre, viomicinre, tilozinra, eritromicinre és hasonlókra. Ezen túl a fentebb leirt antibiotikumrezisztencia átadó DNS szegmensek különböző működőképes származékai is megalkothatok bizonyos nukleotidok hozzáadásával, elhagyásával vagy helyettesítésével. Ezeknek a származékoknak vagy más antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmenseknek a ligálása az itt példákba szedett antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmensek helyett a mintegy 2,5 kb-s KpnI restrikciós fragmenshez olyan plazmidokat eredményez, amelyek szintén a jelen találmány oltalmi körén belül vannak. A jelen Streptomycetesben működő vektorokat, mint pl. a pHJL 2200 és pHJL 2202 plazmidokat ligálni lehet többféle E. coli plazmid replikációt tartalmazó és antibiotikum-rezisztencia hordozó restrikciós fragmensének működőképes kiindulásához (ilyen E. coli plazmidok pl. a pBR322, pBR325 PBR328 és hasonlók), ön-replikáció kétfunkciós vektorokat állítva elő, amelyek kiválaszthatók mind E. coliban, mind Streptomycetesben. Ezek a kétfunkciós konstrukciók a pJL 192 plazmid replikációt tartalmazó fragmensének mintegy 2,5 kb-s Kpn I kiindulásából, egy vagy több olyan DNS szegmensből, amely antibiotikum rezisztenciát ad át Streptomycetesben, egy replikonból, amely működőképes E. coliban, valamint egy olyan DNS szegmensből, amely antibiotikum-rezisztenciát ad át Streptomycetesben, állnak. A jelen találmány bemutatja a pHJL 201 plazmidot, egy kis, mintegy 9,9 kb-s kétfunkciós plazmidot, amely nagyon kevés olyan többletszekvenciát tartalmaz, amely nem vesz részt ennek klónozó vektorként való hasznosításában. A pHJL 201 plazmid kívánatos klónozó vektor viszonylag kis méretét, működési konstrukcióját és BamHI restrikciós helyeinek jelenlétét tekintve, amelyek egyike rendelkezésre áll egy további antibiotikum rezisztencia marker vagy heterológ DNS beiktatásához. Azok, akik a szakterületen jártasak, méltányolni tudják, hogy a pHJL 201 plazmid könnyen kialakítható a pJL 192 plazmid KpnI emésztésével. Ezen kivül az itt példaként felhozott pHJL 201, pHJL 210 és pHJL 211 plazmidok, mint kétfunkciós konstrukciók különösen előnyösek, mivel a plazmidok sokszorozását és manipulálását sokkal gyorsabban és kényelmesebben el lehet végezni E. coliban, mint Streptomycetesben. így, miután a kívánt rekombináns DNS eljárásokat E. coli gazdaszervezet-rendszeren belül elvégezték, a plazmidokat transzformálni lehet egy Streptomycetes gazdasejtbe. Egy másik változat szerint a szóban forgó Streptomycetes DNS-t el lehet távolítani, újból meg lehet alkotni plazmidformára (ha szükséges), majd egy Streptomycetes vagy rokon ' gazdasejtbe lehet transzformálni. Mivel a jelen vektorok teljesen kiválaszthatók Streptomycetesben, a rekombináns kiónok azonosítását hatásosan el lehet végezni. A pJL 192, pBR 322, pBR 325 és hasonló plazmidok különböző replikon restrikciós fragmenseit, valamint a különböző antibiotikum rezisztencia átadó DNS szegmenseket módosítani lehet a ligálás megkönnyítésére, így pl. molekuláris kapcsolókat (linker) lehet szolgáltatni a mintegy 2,5 kb-s Kpnl replikon fragmenshez, valamint a szóban forgó rezisztencia-átadó DNS szegmensekhez, fajlagos helyeket fejlesztve ki az ezt követő ligáláshoz. Ezen kivül a replikációt tartalmazó restrikciós fragmensek kiindulását szintén lehet módosítani bizonyos nukleotidok hozzáadásával, eltávolításával vagy helyettesítésével, hogy megváltoztassuk jellemzőket és a DNS ligélásához restrikciós helyek változatosságát nyújtsuk. Azok, akik a szakterületen jártasak, és értik a nukleotid kémiát és a genetikai kódot, tudják, melyik nukleotidok cserélhetők, és milyen DNS módosítások szükségesek egy kívánt célhoz. A jelen találmány szerinti DNS klónozó vektorok nem korlátozódnak a Streptomycetes csupán egy fajában vagy törzsében való alkalmazásra. Éppen ellenkezőleg, a vektorok széles körben alkalmazhatók és több Streptomycetes faj gazdasejtjeibe transzformálhatók, különösen olyan gazdaságilag fontos faj restrikció nélküli törzseibe, amelyek antibiotikumokat termelnek, pl. aminoglükozidokat, makrolidokat, /3-laktámokat, poliétereket, gli— kopeptid-antibiotikumokat és hasonlókat. Az ilyen restrikció nélküli törzsek könnyen kiválaszthatók és izolálhatók Streptomycetes fajokból, a szakterületen jól ismert hagyományos módszerekkel [Lomovskaya és munkatársai: Microbiological Reviews, 44, 206 (1980)]. A restrikció nélküli törzsek gazdasejtjeinek nincsenek restrikciós enzimei és ennél fogva nem hasítják el vagy roncsolják el a plazmid DNS-t a transzformálás során. A jelen alkalmazás céljaihoz azokat a gazdasejteket, amelyek olyan restrikciós enzimeket tartalmaznak, amelyek nem hasítják a jelen vektorok restrikciós helyeinek egyikét sem, szintén restrikció nélkülieknek tekintjük. A Streptomycetes fajok restrikció nélküli törzseinek javasolt gazdasejtjei azok, amelyek aminoglükozid antibiotikumokat termelnek és amelyekben a jelen vektorok különösen hasznosak és transzformálhatók. Ilyen restrikció nélküli sejtek lehetnek pl a következő fajokból: Streptomyces kanamyceticus (kanamicinek), S. chrestomyceticus (aminosidin) S. griseoflavus (MA 1267 antibiotikum), S. microsporeus (SF-767 antibiotikum), S. ri-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
