197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
12 197351 13 Függelék (C) jelű DNS-szekvencia (kódoló szál) 5’-GAC ACG ACC GTC TCC NH2-Asp Thr Thr Val Ser ACG CTC TAC CAG AGC TGG Thr Leu Tyr Gin Ser Trp AAC GGC TGT GCC GAG ACG Asn Gly Cys Alá Glu Thr TAC GAG GAC GAC ACC GAA Tyr Glu Asp Asp Thr Glu GCA CCG GGC CAG ATC ACC Alá Pro Gly Gin Ile Thr ATC GGC TCG CAC GGC CAC Ile Gly Ser His Gly His TGC CTT TAG-3’ Cys Leu Stp GAG ccc GCA CCC TCC TGC Glu Pro Ala Pro Ser Cys CGG TAC TCA CAG GCC GAC Arg Tyr Ser Gin Ala Asp GTG ACC GTG AAG GTC GTC Val Thr Val Lys Val Val GGC CTG TGC TAC GCC GTC Gly Leu Cys Tyr Ala Val ACC GTC GGC GAC GGC TAC Thr Val Gly Asp Gly Tyr GCG CGC TAC CTG GCT CGC Alá Arg Tyr Leu Ala Arg A P 3 331 860.3 számú NSZK szabadalmi bejelentés 1. és 3. példája: 1. példa Mutációs eljárás Az A 49 847 számú európai szabadalmi iratban leírt, zabpehely-agaron tenyésztett DSM 2727 jelű törzs kb. 0,25 cm^nyi spórázódott micéliumát átoltjuk egy 100 ml-es Erlenmeyer lombikba, amelybe a következő tenyészközegből 25 ml-t töltünk: szójaliszt 2% glükóz 3% kukoricakeményitő 0.2% karbamid 0.1% ammónium-citrát 0.1% maláta extrák tűm 0.5% KH2PO4 0.2% A közeget 30 percig 121 °C hőmérsékleten és 1 bar nyomáson autoklávban kezeljük, a pH-értéke 7,0. Az oltó lombikot 2 napig 30 °C hőmérsékleten, rázógépben inkubáljuk. Az A 49 847 számú európai szabadalmi irat szerint ezután 2 ml-nyi kifejlett előtenyészetet átoltunk egy 20 ml fötenyészkőzeggel töltött 100 ml-es Erlenmeyer lombikba. A főtenyészközeg összetétele: oldható keményitö 2-4% szójaliszt 0.4% folyékony kukoricalekvár 0.4% sovány tejpor 0.7% glükóz 1.0% (NH4)2HP04 1.2% A közeg pH-értéke az autoklávban történő kezelés után 7,6. Ehhez a közeghez 10-25 Mg/ml koncentrációban Acriflavint adunk mutagén ágensként. A tenyészetet 5 napig 28 °C hőmérsékleten 220 min'1 frekvenciával rézatjuk. Ezután a tenyészoldatot centrifugáljuk (1300 g, 5 perc) és a sejttömeget a fő tenyészközeggel mossuk. A mosott sejteket üveghomogenizátorral fragmentáljuk és az alábbi összetételű agarlemezekre szélesztjük: Nádcukor 0.30% 25 Dextrin 1.50% NaCl 0.05% K2 HPO4 0.05% FeS04x7H20 0.001% Trip tone Soja Broth 0.05% 30 (Oxid cég gyártmánya) Hús extraktum (Difco cég gyártmánya) 0.10% Élesztő extraktum (Difco cég gyártmánya) 0.20% 35 Agár (Merck cég gyártmánya) 1.50% Az oldat pH-értéke 7,1 (az autoklávos kezelés megegyezik a fentiekben leírttal). A lemezeket 5 napig 28 °C-on tenyészt- 40 jük, és az egyes telepeket ferde zabpehely-agarral oltjuk át. Ezeket az előbbiek szerint tovább tenyésztjük, mig a micéliumok spórázódnak. A spórázódott micéliumot a már leírtak szerint elő- és főtenyészetben szaporít- 45 juk és az 5 napos főtenyészet szüredékét az A 49 847 számú európai szabadalmi irat szerint tendamistat-tartalomra vizsgáljuk. Ilyen módon az 1-9353, 1-9362, 1-9417 és 1-9418 jelű törzseket szelektáljuk. Ezek a törzsek 50 fejlődési periódusukban, a leirt feltételek mellett kb. 90 000-100 000 NE tendamistatot termelnek 1 liter tenyészoldatra vonatkoztatva, azaz 1,5-1,8 g/1 inaktivátort. 55 3. példa A dezoxiribonukleinsav izolációja S. tendae-ból és molekuláris biológiai jellem- 60 zése. A sejtek tenyésztése az 1. példában leírtak szerint történik. A fő tenyészközegben való három napos fejlődés után az egyik Er- 65 lenmeyer lombik sejtjeit 4 °C hőmérsékleten, 8
