197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására

14

197351

15

3000 g gyorsulással 5 percig centrifugálva összegyűjtjük és kétszer 50-50 ml, 50 mmól-os Tris/HCl pufferból, 100 mmól-os NaCl-ból és 25 mmól-os EDTA-ból álló oldattal mossuk. A szilárdra centrifugált sejtekből 3 g-ot -198 °C hőmérsékleten, folyékony nitrogénben, sokkszerűen mélyhűtünk és ezt követően vágókéses homogenizátorban (Warring Commercial Blender), nitrogénben finom porrá homogenizáljuk. Ezt a port 10 ml-nyi, az előbbiekben megnevezett puffer oldattal elegyítjük, jégre helyezve (0 °C-on) feloldjuk és 0,8 ml 30 mg/ml koncentrációjú lizozim-oldat hozzáadása után 20 percig 28 °C hőmérsékleten enyhe rázással inkubáljuk. A szuszpenzióhoz 0,8 ml 15 mg/ml-es proteináz K oldatot és az N-lauroil-szakrozin nátrium sójának 20%-os oldatából 0,8 ml-t adunk hozzá. Óvatos keverés után a keveréket jégre helyezve (0 °C-on) 30 percig és szobahőmérsékleten további 15 percig inkubáljuk. 22 g szilárd cézium-klorid hozzáadása és feloldása után a már említett puffer oldattal a térfogatot 22 ml-re egészítjük ki és a szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten 12 000 g gyorsulással 25 percig centrifugáljuk. A centrifugált termék tisztájához etidium-bromidot adunk és a törésmutatóját CsCl-al n=l,3920 értékre állítjuk be. Preparativ ultracentrifugálás után (120 000 g, 36 óra, 15 °C) a kromoszomális DNS sávját a centrifugacsőből kivesszük és azonos feltételek között újracentrifugáljuk. Az izolált sávot n-butanollal történő kirázással az etínium-bromidtól mentesítjük és a CsCl maradéktalan eltávolítása érdekében dializáljuk. Az így nyert DNS hasítható, például Pst I, Bam HI, Sau 3 A, Cia I, Bgl II és Xho I enzimekkel és nem hasítható Eco R I és Hind III endonukleázokkal. Az 1-9353 és 1-9362 mutánsokból nyert DNS-t az ATCC 31 210, illetve a DSM 2727 DNS-ével ellentétben egy erősitett genetikus elem jellemzi, amelynek egyes fragmensei az etídium-bromid fluoreszcens színezékkel történő megfestés után a nem szelektíven szaporított fragmensek hátteréből jól láthatóan előtűnnek. Az erősitett elem nagyságát, valamint a restrikciós endonukleázokkal történő emésztetés után keletkező egyes jellemző fragmenseket a következő táblázatban adjuk meg:

Fragmens Fragmens nagyság (Kbp) sorszáma Pst I Xho I Bam H I

1.

9.0

13.5

7.2

2.

7.0

11.5

6.1

3.

6.8

9.3

5.3

4.

4.6

2.8

2.9

5.

3.4

0.7

2.6

6.

3.1

2.5

7.

2.3

2.15

8.

1.1

2.1

9.

1.5

10.

1.2

Fragmens Fragmens nagyság (Kbp)

sorszáma Pst I Xho I Bam H I

11. 1.1

12. 1.0

13. 0.8

14. 0.5

15. 0.48

Összesen: 37.3 37.8 37.43 * 1

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás genetikailag kódolható aminosavakból álló polipeptidek előállításának megkönnyítésére, azzal jellemezve, hogy egy, a polipeptid szerkezeti génjével azonos leolvasókeretben egy prepeptid (B) DNS-szekvenciáját tartalmazó génszerkezetet, amely szekvencia tendamisztatot termelő, acriflavin szubletális dózisával kezelt Streptomyces tendae törzsből nyerhető, és amely szekvencia

a) közvetlenül a szerkezeti gén előtt helyezkedik el,

b) az amino-végen a Met-Arg-Val-Arg-Ala-Leu-Arg sorrendet kódolja,

c) a karboxi-végen az Ala-Ser-Ala sorrendet kódolja, és

d) középen egy hidrofób tartományt kódol, amely 10-25 arainosavat tartalmaz,

egy Streptomyces nembe tartozó gazdasejtbe beviszünk, amely gazdasejt egy, a prepeptidet lehasítani és a kívánt polipeptidet a tenyészközegbe kiválasztani képes szignálpeptidázt tartalmaz és az így kialakított transzformánst megfelelő tápközegen tenyésztve a genetikai információt kifejezzük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prepeptid DNS-e olyan középső hidrofób tartományt kódol, amely 17-20 aminosavat tartalmaz.

3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy S. tendae-ből izolált prepeptid (B) DNS-szekvenciát használunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként a S. tendae vagy a S. lividans fajok sejtjeit alkalmazzuk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljái'ás, azzal jellemezve, hogy a génszerkezetet a gazdasejtbe egy olyan plazmiddal visszük be, amely a Streptomycesekben hatásos replikont tartalmaz.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan plazmidot alkalmazunk, amely a Streptomycesekben hatásos replikonon kívül E. coli-ban hatásos replikont is tartalmaz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9