197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
10 197351 11 plazmid, amely a tendamistat-gént hordozó részletet fordított orientációval tartalmazza. Ezzel szemben a beiktatott részlet lecsökkentése 1,5 kb nagyságra semmilyen szignifikáns hatással nincs a termék-képződésre. 11. példa A tendamistat gén szerkezetének és nukleotid-szekvenciájának meghatározására a 0,94 kb Pst I-Bam HI-szubfragmenst (2a és b ábra) valamint a 295 bp Sau 3a-Bam HI-Bzubframgenst (2c ábra) az M 13 mp 8 és az M 13 mp 9 jelű egyszálas fágokkal klónozzuk. A di-dezoxi-szekventáló reakcióhoz primerként a 20 nukleotidot magában foglaló (A) jelű DNS-szekvenciát, valamint egy kereskedelemben (Bethesda Research Laboratories GmbH, Neu-Isenburg) kapható 15 bp prímért használunk. Eredményként a (C) jelű DNS-szekvenciát kapjuk. 12. példa A tendamistat szerkezeti génje előtt a DNS-en egy nyitott leolvasó keret található, 5 amely az ATG (Met) kezdő kódig terjed, és amely egy, a tendamistat aminoterminális végéhez közvetlenül csatlakozó proteint kódol. Ennek a szignálpeptidnek a (B) jelű DNS-szekvencia felel meg. 10 13. példa Interleukin-2 termelése 15 A 9. példa szerinti pKAI 2 plazmidot XmalTI-mal és Pstl-gyel hasítjuk, és a kis fragmenst eltávolítjuk. A XmalII vágóhely a tendaraísztat-6zignálszekvencíában helyezke- 20 dik el, éspedig a C-termilás vég közelében (a 24-26. aminosavak területén). A nagy fragmenst egy olyan szintetikus génnel ligáljuk, amely a maradék szignálszekvenciát, aszparagint (amely a tendamisztat első aminosava) és 25 az ahhoz csatlakozó interleukin-2-t kódolja. Ezt a szintetikus gént a 163 249 sz. európai szabadalmi bejelentésben ismertetett módon állítjuk elő, a leirt gént azonban a kővetkezőképpen módosítjuk: 25 Alá Gly Pro Alá GCC GGG CCG GCC CCC GGC CGG (XmalII) 30 1 Ser Alá Asp Alá TCC GCC GAC GCG AGG CGG CTG CGC Interleukin-2 Szignálpeptid 133 Thr ACC TGA TAG CTG TGG ACT ATC G (PstI) Az így kapott plazmidot Pstl-gyel linearizáljuk, és a szintén Pstl-gyel felnyitott pIJ 350 expressziós plazmidba ligáljuk a 9. példa szerinti módon. A szelektálást a triosztrepton-rezisztencia alapján végezzük (v.ö. 10. példa). A kiválasztott interleukin-2-t az említett európai bejelentésben ismertetett teszttel vizsgáljuk. 14. példa Hirudin termelése A 13. példa szerinti módon járunk el, szintetikus génként azonban a 2980/85 sz. magyar szabadalmi bejelentés szerinti módon előállított gént használjuk, melynek szekvenciája a következő: 25 30 1 64 Ala Gly Pro Alá Ser Alá Asp Thr Gin G GCC GGG CCG GCC TCC GCC GAC ACG ... CAG TGA TAG CTG CA CCC GGC CGG AGG CGG CTG TGC GTC ACT ATC G (XmalII) Szignálpeptid Hirudin (PstI) A kiválasztott hirudint véralvadási teszttel (trombingátlás) vizsgáljuk. 7
