197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
8 197351 9 3’ AGC TCG ACG TCG AGC T 5’ szerkezetű Pst I-linkert (0,4 Mg DNS-hez 2 Mg linker, pl, a 932/85 sz, magyar szabadalmi bejelentésben ismertetett módon előállítva) ligálunk, A DNS-t fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a kicsapódás után kapcsolható Pst I-végek kialakítása érdekében Pst I enzimmel emésztetjük. Ezután a DNS-t defoszforiláljuk, ismét fenol-kloroform eleggyel extraháljuk és a részlegesen Pst I enzimmel emésztett (Maniatis et al., id.h. 282. oldal) pAX la plazmiddal kapcsoljuk. A kapcsolt keveréket HB 101 (ATCC 33 694) illetve MC 1061 jelű (F. Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Intersciences, New York 1986, 1. 4. 9.) E. coli-ba transzformáljuk. A kloramfenikollal szemben rezisztens kiónokat a lemezről leöblítjük és a DNS-t izoláljuk (Maniatis et al., id.h. 444. oldal szerinti módon). A TK 24 jelű S. lividans törzset 1-2 Mg DNS-sel transzformáljuk és megvizsgáljuk, hogy tendamistatot termelnek-e (3. példa szerinti módon). A tendamistat vizsgálatban pozitívan reagáló kiónokat izoláljuk, a plazmid-DNS-t lúgos lizissel izoláljuk [Bimbóim, H.C. and Doly, J., Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)] és a HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli-ba visszatranszformáljuk. A szaporítás után újra izolált plaznfidok nem különböznek a S. lividans törzsekből izolált plazmidoktól. A tendamistat gént hordozó beiktatott részlet iroentációja szerint a rekombináns plazmidokat pSA 2a-val vagy pSA 2b szimbólummal jelöljük (5a és b ábra). 6. példa Az 5. példában leirtak szerint járunk el, de pAX 350 plazmidból indulunk ki, E. coli-ban a klóramfenikol-rezisztencia, S. lividans-ban a tiosztrepton-rezisztencia és végül a tendamistat termelés szerint szelektáljuk, Így a pSA 351a és b jelű plazmidokat kapjuk (6a és b ábra). 7. példa Az 5. példában leirtak szerint járunk el, de a pAC 184 jelű plazmid helyett pAC 177 jelű plazmidból indulunk ki, az igy kapott pSA 3a illetve b plazmidokat a 7a és b ábra mutatja. Ennél az eljárásnál a pAXl a jelű plazmidot Pst I-el részlegesen hasítjuk, és az enzimet 15 percen keresztül 68 °C hőmérsékleten végzett melegítéssel inaktiváljuk. A DNS-t a pAC 177 jelű, Pst I-el hasított, defoszforilált és deproteinált plazmidhoz ligái— juk. A HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli transzformációja után a kanamicinnel szemben rezisztens kiónokat a lemezről leöblítjük, a plazmid-DNS-t izoláljuk és 1-2 Mg ilyen DNS-el a TK 24 jelű S. lividans-t transzformáljuk. A tendamistatot termelő kiónokat szelektáljuk és a plazmidot jellemezzük. 8. példa A 7. példában leírtak szerint járunk el, de a pAX la jelű plazmid helyett a pAX 350a jelű plazmidot alkalmazzuk és a S. lividansban a tiosztrepton-rezisztencia szerint szelektálunk, igy a pSA 352a illetve b jelű plazmidokat kapjuk (8a és b ábra). 9. példa Mint azt a 2. ábra mutatja, a tendamistatot és a szignál-szekvenciát kódoló gén mintegy 0,3 kb nagyságú. Az előző példákban alkalmazott 2,3 kb-fragmens tehát rőviditett alakban olyan hibrídplazmidok készítéséhez alkalmazható, amelyek a tendamistat termelését biztosítják. A pKA I la jelű plazmidot Sál I-el emésztetjük és újra ligáljuk. igy kapjuk a pKA I 2 jelű, kb. 750 bázis-párral lerövidített plazmidot. Ezt klónozzuk, izoláljuk és Pst I-el hasítjuk. A DNS-t borjúbélből származó lúgos foszfatázzal defoszforiláljuk és fenolos kloroformmal proteinmentesítjük. A pIJ 102 jelű plazmidot Pst I-el teljesen hasítjuk, és a fragmenseket az enzim hó-inaktiválása után a pKA I 2 Pst I hasítási helyeire ligáljuk. A ligációs keveréket H 101 vagy MC 1061 jelű E. coli-ba transzformáljuk. A plazmid-DNS-t az ampicillinnel szemben rezisztens kiónokból lúgos gyors lizis-eljárással izoláljuk, és a TK 24 jelű S. lividans-t 1-2 Mg ilyen DNS-el transzformáljuk. A tendamistat-termelés szerint szelektálunk és a megfelelő kiónok plazmid-DNS-ét lúgos gyors lizissel izoláljuk. A HB 101 illetve MC 1061 jelű E. coli-ba történő visszatranszformálás és a plazmíd-DNS-nek a transzformált E. coli törzsekből történő izolálása után restrikciós analízissel jellemezzük a pSA 1 jelű plazmidot (9. ábra). A plazmid nem különbözik a S. lividans törzsekből izolált plazmidtól, de az E. coliból történő DNS-feldolgozás termelékenyebb és rövidebb idő alatt lehetséges. 10. példa A 9. példában leírtak szerint járunk el, de a pIJ 102 jelű plazmid helyett a pIJ 350 jelű plazmidot alkalmazzuk és a S. lividans-ban kiegészítőleg a tiosztrepton-rezisztencia szerint is szelektálunk, igy kapjuk a pSA 350a, illetve b plazmidot. A 10. ábra mutatja a pSA 350a jelű plazmidot. Ez a plazmid a rázatott tenyészetekben nagyobb tendamistat kitermeléshez vezet, mint a pAS 350b jelű 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
