197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
6 197351 7 nukleotid-kináz segítségével radioaktivan megjelöljük. Ennek a radioaktív mintának a teljes DNS-ben lévő komplementer DNS-szekvenciához történő hibridizálása érdekében a keveréket 24 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Ezután a meg nem kötődött radioaktív DNS-t eltávolítjuk, és a szűrőt 37 °C hőmérsékleten ötször 30 percenként 200-200 ml hibridizáló közeggel mossuk és ezt kővetően autoradioagrafáljuk. 24 órás expozíció után a hibridizációs jelek azt mutatják, hogy a gén egy 2,3 kb Pst I-fragmensen helyezkedik el. Ezt a fragmenset egy preparativ agaróz-gélböl származó, ennek a fr'agmensnagyságnak megfelelő kivágás elektroelúciójával nyerjük, amely agaróz-gélre a teljes, Pst I-vel emésztett DNS-t felvittük. Az eluált DNS-t a pUC 8 plazmid Pst I hasítási helyébe klónozzuk (50 jul reakciótérfogat, 0,5 Mg DNS, Maniatis, id. h. 289. oldal). Ezeket a hibrid plazmidokat JM 103 jelű E. coli-ba transzformáljuk (Maniatis et al., id. h. 250. oldal) és szaporítjuk. Azokat a kiónokat, amelyek a keresett tendamistat-gén részletet hordozzák. (A) jelű radioaktiv DNS mint a felhasználásával telep-hibridizációval mutatjuk ki. Az Így kapott pKA I la, illetve lb hibridplazmidokat az l._a és 1. b ábra mutatja. A gén helyzetét az izolált 2,3 kg Pst I-fragmenssel és ennek szubfragmenseivel végzett további Southern-hibridizációkkal pontosan meghatározhatjuk (2. a, 2. b, 2. c ábrák). 2. példa A pIJ 102 plazmid szinguláris Pst I hasítási helyére [Kieser et al., Molecular General Genetics 185, 223-238 (1982)] klónozzuk a S. tendae-ből származó 2,3 kb Pst I-fragmenset. Az így kapott pAX la és lb hibridplazmidok, amelyek a lényeges részlet orientációjában különböznek, S. lividans törzsekbe történő transzformáció után alkalmassá teszik ezen törzseket tendamistat termelésre. A 3. ábra mutatja a pAX la pl&zmidot. 3. példa A TK 24 jelű, kereskedelemben (John Innés Institute, Norwich, Anglia) kapható S. lividans törzset ismert módon protoplaszttá alakítjuk [Chater, K. F. etal., Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 69-95 (1982)], és 1 MS PAX la jelű hibridplazmidot adunk 10® protoplaszthoz, 20% poli-(etilén-glikol) 6000 adagolása mellett. A transzformáit protoplasztot R2YE regenerációs közegen [Thompson és társai: Nature 286 (1980) 525. oldal] 30 °C hőmérsékleten 5 napig tenyésztjük. A sejten kívüli amiláz inaktivátor, azaz a tendamistat képződésének kimutatását lemezes vizsgálattal végezhetjük: A regenerált telepekre 5 ml 0,4-1,0 mg/ml pankreatint tartalmazó vizes oldatot öntünk és 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. Az oldatot ezután leöntjük és 5 ml 2%-os keményítő agari‘al helyettesitjük. A lemezekre 2 órás 37 °C hőmérsékleten történő inkubáció után 5 ml kálium-jodidos jódoldatot öntünk a szinelőhivás céljából. Ha a telepeknek kék udvara képződik, akkor az azt mutatja, hogy a kiónok tendamistatot szintetizálnak és választanak ki. Ellenőrzésként a tendamistatot termelő, jól spórázódó törzsekből a plazmid-DNS-t izolálhatjuk és feltérképezhetjük. Minden tendamistatot termelő törzsben előfordul a beültetett plazmid-DNS. 4. példa A 2. példában leírtak szerint járunk el, de pIJ 350 jelű plazmidot alkalmazunk, amely tiosztrepton-rezisztencia gént hordoz és ez a Streptomycesekben szelekciójelzöként működik. Ezzel az eljárással a pAX 350 a és b jelű hibridplazmidokat kapjuk, amelyek a beiktatott részlet orientációjában különböznek. A 4. ábra mutatja a pAX 350 a jelű plazmidot. A 3. példa szerinti transzformáció után minimál-közegre [Hopwood: Bacteriological Reviews 31 (1967) 373-403. oldal] szelektáljuk a rezisztens kiónokat 50 Mg/ml tiosztrepton jelenlétében, és vagy közvetlenül a minimál-közegen, vagy nem szelektív R2YE-agarra történő átvitel után vizsgáljuk a tendamistát-termelést. 5. példa A 2,3 kb Pst I-fragmenset tartalmazó hibrid plazmidok, amelyek a Streptomyce6- -replikonon kívül E. coli-replikont is tartalmaznak, mint .Shuttle "-vektorok egy sor előnnyel rendelkeznek. Ezek a hibrid plazmidok az E. coli-replikon és az E. coli-ban hatásos rezisztencia jelzők alapján ezekben a szervezetekben jól szaporíthatok. Izolálás és Streptomycesekbe - különösen S. lividans-ba - történő transzformáció után nagy a stabilitásuk. A Streptomycesekben hatásos szelekció jelzőik és a Streptomyces-replikon következtében ezekben a szervezetekben is jól szaporíthatok és exprimálhatók és tendamistatot választanak ki. A pAC 184 jelű plazmidot a Sal I restrikciós enzimmel teljesen megemésztetjük és az enzimet fenol-kloroformos extrakcióval eltávolitjuk. A kiálló 5' végeket ATP, CTP, GTP és TTP jelenlétében DNS-polimeráz enzim (Klenow-fragmens) segítségével feltöltjük. A tompa végekre (blunt ends) 16 °C hőmérsékleten történő ligáz-reakcióval (Maniatis et al., id.h. 243-244) az 5’ TCG AGC TGC AGC TCG A 3’ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 * 65 5
