197351. lajstromszámú szabadalom • Eljárás genetikusan kódolható aminosavakból álló polipeptid előállítására
4 197351 5 plazroid képes lesz arra, hogy a szerkezeti génnel meghatározott peptidet a (II) általános képletű propeptid formájában kifejezze, amelyet aztán a folyamat során a szignálpeptidáz hasit, és a kívánt peptid a tenyészközegbe kiválasztódik. Előnyösek az úgynevezett .Shuttle (ingázó) plazmidok is, amelyek úgy E. coli-ban, mint a Streptomycesekben hatásos replikont tartalmaznak. Ezek a .Shuttle" plazmidok E. coli-ban szaporithatók és reizoláció után Streptomycesekbe transzformálhatok, ahol a kívánt polipeptid termelése megtörténik. A találmány tárgyához tartoznak azok a gazdaszervezetek is, amelyeket a megemlített plazmidokkal transzformáltunk, különösen a Streptomyces nemhez tartozó gazdaszervezetek, mindenek előtt az S. tendae vagy különösen a S. lividans. A találmány tárgya továbbá eljárás egy (III) általános képletű polipeptid előállítására, HzN-R’ (III) a (III) általános képletben R’ jelentése a (II) általános képletben R jelentésénél megadott peptid maradéka. Az eljárásban a fent nevezett, transzformált gazdaszervezeteket alkalmazzuk, amelyek olyan szignálpeptidázt tartalmaznak', amely a (II) általános képletű propeptidet bontja és a kívánt polipeptidet kiválasztja. Míg a Gram-nçgativ baktériumokhoz nagy számban ismertek vektorok, addig a Gram-pozitiv baktériumokhoz csak kevés vektort Írtak eddig le. A S. tendae baktérium fajhoz eddig nem voltak ismert vektorok. Találmányunk lehetővé teszi a S. tendae gazdaszervezetként történő használatát. A találmány rendkívüli előnye, hogy a transzformált Streptomyces törzsek, különösen a S. lividans törzsek optimálisan spórázódnak, azaz a rekombináns plazmid-tartalom nem befolyásolja ezen törzsek generatív fázisát. A transzformált szervezetek igy további törzs javításra is alkalmasak, például metabolikus mutánsok előállítására és szelekciójára, amelyek előállításánál spórákkal dolgozunk. A S. tendae ismert törzseivel ellentétben a transzformált törzsek, különösen a S. lividans, nem termelnek melanint. igy ennek elválasztása elmarad, ezzel a kívánt peptid, például a tendamistat izolálása lényegesen könnyebbé válik és a kitermelési veszteség is csökken. A találmány további előnye, hogy az idegen gént is S. lividans-ban exprimáljuk és a megfelelő polipeptidet kiválasztjuk, ez szintén a törzsjavitás és az igy előállított polipeptid módosítása sokoldalú lehetőségét szolgáltatja. A találmány szerinti eljárással más Streptomyces fajok is transzformálhatok, például a S. ghanaensis vagy a S. aureofaciens. Ha plazmidmentes törzseket, amelyek képesek specifikus szignálpeptidázt szintetizálni, a találmány szerinti hidrid plazmidokkal transzformálunk, akkor stabil transzformált szervezeteket kapunk, amelyek a kódolt peptidet kifejezik és kiválasztják. A találmányt a következő példákkal világítjuk meg. A hibrid plazmidokat ábrázoló rajzokon a hasítási helyeket méretarányosan tüntettük fel. A példákban a következő, irodalomból ismert vektorokat alkalmazzuk: M 13 mp 8 és M 13 mp 9 jelű egyszálas fágok a Messing és munkatársai: Gene 19 (1982) 269. oldal irodalmi közlemény alapján: p UC a Vieira és munkatársai: Gene 19 (1982) 259. oldal irodalmi közlemény alapján: P AC 177 és 184 a Chang és munaktársai: Bacteriology 134 (1978) 1141. oldal irodalmi közlemény alapján; pIJ 102 és 350 a Kieser és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 185 (1982) 223. oldal irodalmi közlemény alapján. A S. tendae törzs eltartásét a 4 226 764 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leirás ismerteti. A tendamistat gén izolálása alapvetően minden tendamistatot termelő törzsből megtörténhet. Ennek ellenére különösen előnyös a P 3 331 860.3 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentés szerint eljárni, amelynek 3. példájában leírták a DNS izolálását (lásd függelékben). Ez az izolált teljes DNS a következő 1. példa kiindulási anyaga. A példákban ismertetett eljárásokban az enzimeket a gyártó cégek által javasolt módon alkalmazzuk, illetve a Maniatis et al., Molecular Cloning, 1982 helyen ismertetett módon járunk el, hacsak másképpen nem jelezzük. 1. példa 5 ug DNS-t a Pst I restrikciós enzimmel teljesen megemésztettünk, és 0,8%-os agaróz gélben történő szétválasztás után nitrocellulóz szűrőre visszük fel (Southern átvitel). A szűrőt a megkötött, denaturált DNS-sel 6 órán keresztül előbibridizáljuk 5 ml előhibridizáló közegben (0,6 mól NaCl, 0,06 mól Na-EDTA, 0,1% nátrium-dodecilszulfát oldat, 100 Mg/ml ultrahanggal kezelt borjú csecsemőrairigy-DNS és 4-szeresen koncentrált Denhardt-oldat). Ezt követően ismét 5 ml előhibridizáló közeggel kezeljük, amelyhez 500 000 cpm/ml radioaktív izotóppal jelzett DNS-t adunk. Ezt a radioaktív izotóppal jelzett mintát a következők szerint állítjuk elő: Az (A) jelű DNS-szekvéneiét foszfit-eljárással szintetizáljuk. Ez 20 nukleotidot tartalmaz (a molekulatömege kb. 13 000). komplementerje a tendamistat feltételezett DNS-szekvenciájának és az E. coli által kedvelt triplett használatával a tendamistat 37-dik aminosavjától kezdődő tendamistat-aminosav-szekvenciából származtatjuk. Ezt az (A) jelű DNS-szekvenciát az 5* végen ü-^P-ATP és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
