197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
11 197349 12 külső eredetű proteint határoznak meg. érett külső eredetű protein előállítására az utóbbi kifejeződő terméket ismert módon (lásd például Light és munkatársai, mint előbb) enterokinázzal kezeljük. A találmány szerinti klónozó vektorokat több gazdasejtben használhatjuk, például Gram-negativ festódésű prokariota mikroorganizmusokban, például Escherichia coli, Serratia, Pseudomonas sejtekben és hasonlókban; Gram-pozitiv festódésű prokariota organizmusokban, mint például Bacillus vagy Steptomyces sejtekben és másokban; használhatjuk ezeket eukariot£ organizmusokban is például Saccharomyces sejtekben is. Előnyösen azonban gazdasejtként Gram-negativ prokariota organizmust használunk. Különösen előnyös az E. coli, például az E. coli K- 12 törzse, mint például az RV308. Jól ismert módszereket használunk a megfelelő gazdasejt találmány szerinti vektorokkal való transzformálásra, a sejtekben sokszorosítjuk a vektorokat, és standard fermentációs körülmények között fejezzük ki a külső eredetű protein terméket. A protein terméket a kapott tenyészetből ismert módszerekkel izoláljuk. A találmány szerinti klónozó vektorok szerkezetét és funkcióját az alábbi példákban szemléltetjük, A példákat a mellékelt ábrák alapján kell elolvasnunk és megértenünk. Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat. Az 1-4. ábrákon a találmány szerinti klónozó vektorok mindkét előállítási változata során használt intermedierek és kiindulási anyagok preparálását ismertetjük. Az 1-4. ábrákkal összefüggő 5. ábrán sematikusan szemléltetjük az 1. példában ismertetett módszert, amellyel a metionil-humán növekedési hormon termelésére használható klónozó vektort állítjuk elő. Az 1-5. ábrákkal összefüggő 6-8, ábrákon együttesen szemléltetjük a 2. példában ismertetett módszert a metionil-marha növekedési hormon előállítására használható klónozó vektor izolálására. A 9. ábrán, amely összefügg az 1-5. ábrákkal, sematikusan ábrázoljuk a 3. példában megadott módszert, amellyel az 1. példa szerinti klónozó vektor egy variánsát állítjuk elő, és amelyet a metionil-humán növekedési hormon termelésére használhatunk. Az 1-4. ábrákkal összefüggő 10. ábrán sematikusan ábrázoljuk a 4. példában ismertetett módszert a találmány szerinti klónozó vektorok második típusainak előállítására, ezeket a vektorokat a humán növekedési hormon előállítására használjuk fel. Az 1-4. és 10. ábrákkal összefüggő 11-13. ábrákon sematikusan ábrázoljuk az 5. példában megadott módszert, amivel a második kivitelezési változat szerinti, és a marha növekedési hormon előállítására használható klónozó hordozót állítjuk elő. A találmány szerinti plazmidok első és második típusainak előállításakor használt köztes termékek és kiindulási anyagok készítését az alábbiakban ismertetjük. Kiindulási anyagként pKEN021 plazraid vektor (lásd a 3. ábrán a 106. sorszámot) Xbal (5’-TCTAGA-3’) és BamHI (5’-GGATCC- 3’) restrikciós endonukleázokkal való hasításakor kapott 5,1 kb nagyságú fragmenst használjuk. A pKEN021 az első ábra 101. helyén bemutatott pKENlll származéka [Lee és munkatársai, J. Bact., 146, 861-866 (1981); és Zv-iebel és munkatársai, J. Bacht., 145, 654- -656 (1981)]. A plazmid az E. coli CC620 törzsben van (NRRL 15 011). A pKENlll plazmidnuk egy 2,8 kb nagyságú fragmensén rajta van az E. coli lipoprotein génje. A fngmens leírását Nakamura és Inouye adja meg [Cell, 18, 1109-1117 (1979)]. A pKEN021 plizmidban az egyetlen EcoRI (5’-GAATTC-3’) és a Sáli (5’-GTCGAC-3’) pBR322 restrikciós hely közötti 650 bázispárból álló szekvenciát kicseréltük az E. coli lipoprotein génből izolált szekvenciával. Az összes, ebből a génből származó funkcionális rész nukleotid-szekvenciáját meghatározták. A lipoprotein génszekvencia [Nakamura és Inouye, Cell, IS, 1109-1117 (1979)] egy 462 bázispárból álló Alul (5’-TCTAGA-3’) fragmenst hordoz a lipcprotein gén első kodonjától (metionin) balra esve. Ez a fragmens tartalmazza a promote rt, az 5’-nem-transzlatált szakaszt és a riboszóma kötőhelyet. A riboszóma kötőhelyen belül 16 bázispárral a transzlációs iniciációs metionin kodonja előtt egyetlen Xbal (5’-TCTAGA-3’) restrikciós hely létezik. A strukturgén transzlációs terminációs kodonjá'ől balra eső (105 bázispárral) PvuII (5’-CCAGCTG-3’) restrikciós helyet kicseréltük egy BamHI (5’-GGATCC-3’) restrikciós helylyel, úgy, hogy egy szintetikus DNS adapter fragmenst kapcsoltunk. (5’-CCGATCCGG-3‘; a Collaborative Research terméke). A BamHI helyett a lipoprotein utolsó 35 aminosavát meghatározó kódoló szekvencia, a transzlációs terminációs kodon és az mRNS 3'-nem-transzlatált szakaszának megfelelő szekvencia követi. A pKEN021 plazmid tartalmtz továbbá egy 85 bázispárból álló, különleges szekvenciát, amely nincs kapcsolatban a lipoprotein génnel, és amely az E. coli kromoszómában ettől jobbra helyezkedik el. Ez a szekvencia azért létezik, mert a gén eredeti izolálása során használt módszerek és restrikciós enzimek által felismerhető helyek természetéből következik. Az 1., 2. és 3. ábra kapcsán megadjuk az alábbiakban azt a módszert, amellyel a pKENlll plazmidból előállítjuk a pKEN021 plazmidot. Úgy járunk el, hogy 50 jug pKENlll (1. ábra 101.) plazmidot 25 egység Hpall (5’-CCGG-3’) restrikciós enzimmel kezelünk, 300 jul alábbi összetételű pufferban: 20 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4 10 mmól magnézium-klorid, 5' 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
