197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
13 197349 14 6 mraól ß-merkapto-etanol, literenként. A reakciót 2 órán át végezzük 37 C° hőmérsékleten. Kétszer 300 pl alábi eleggyel extraháljuk a reakcióelegyet: fenol és kloroform 50:50 arányú elegye. A vizes fá.’ist 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 100 pl elektroforézis-pufferban olajuk, és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. A gélt 0,5 pg/ /ml etidium-bromid-oldattal festjük, és a csíkokat a távolabbi tartományba eső hullámhosszúságú ultraibolya fényben figyeljük meg. Elektroelúcióval egy dialízis zsákba izoláljuk a 950 bázispárból álló csíkot. A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, majd a 2,5 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsavat 25 pl TEN-elegyben oldjuk. Ennek összetétele a következő: 10 mmól nátrium-klorid, 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,4, és 1 mmól nátrium-etilén-dinitril-tetraecetsav, pH = 8,0, literenként. 2 pg, 950 bázispárból álló Hpall fragmenst Alul (5’-AGCT-3’) restrikciós enzimmel kezelünk 200 pl alábbi összetételű pufferban: 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,6, és 6 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. A reakciót 37 C° hőmérsékleten végezzük, 2 órán át. A dezoxi-ribonukleinsavat 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk, és a keletkezett 462 bázispárból álló Alul fragmenst az előzőekben megadottak szerint eljárva izoláljuk és tisztítjuk. A 462 bázispárból álló Alul fragmens 1 pg-ját 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferben oldjuk. Ennek összetétele a következő: 66 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = 7,6 10 mmól magnézium-klorid, 10 mmól ditio-treitol, 0,4 mmól adenozin-trifoszfát, literenként. Az elegyhez előzőleg 150 pikomól foszforilezett EcoRI linkért adunk (5*— -GGAATTCC-3’, a Collaborative Research terméke), majd 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk, és ezután 100 pl-re hígítjuk EcoRI puffer adagolásával. Ennek összetétele a következő: 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,2, 50 mmól nátrium-klorid, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol, literenként. Az elegyhez 40 egység EcoRI enzimet adunk. 2 órán át 37 C° hőmérsékleten inkubálunk, majd az elegyet fenol és kloroform 8 elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A dezoxi-ribonukleinsavat 20 pl, 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz-pufferban oldjuk, ehhez előzőleg 0,1 pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat (lásd 1. ábra 102.) adunk, amelyet EcoRI enzimmel linearizáltunk, és a molekula végein lévő foszfátcsoportok eltávolítására alkalikus foszfatázzal kezeltünk. A ligációs reakciót 16 órán át 4 C° hőmérsékleten végezzük, majd az eleggyel megfelelő E. coli törzset (hsr~, hsm*) transzformálunk, például HB101 sejteket. A baktérium sejteket kompetenssé tesszük a transzformálásra, az ismert kalcium-lcloridos kezeléssel. A transzformónsokat 12 pg/ml tetraciklint tartalmazó agar-lemezeken szelektáljuk. Több tetraciklinre rezisztens telepből izoláljuk a plazmidokat, a plazmid-izolálást a Bimbóim és Doly gyors alkalikus extrakciós módszerével végezzük [Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. Az 1. ábra 103. számmal jelzett helyén bemutatjuk azt a plaznüdot, amely tartalmaz egy 466 bázispárból álló Xbal, BaniHI fragmenst, mégpedig a kívánt orientációban. Ezt kiválasztjuk, és a következő lépésben kiindulási lépésként használjuk. 2 pg, a 2. ábra 103. számmal jelölt helyén bemutatott, egy HindlII (5’-AAGCTT-3’) restrikciós hellyel rendelkező plazmid dezoxiribonukleinsavat 2 egység HindlII enzimmel emésztünk 50 pl alábbi összetételű HindlII-pufferban: 60 mmól nátrium-klorid, 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH = = 7,4, 10 mmól magnézium-klorid, és 6 mmól [i~ merkapto-etanol, literenként. A reakciót 1 órán ót végezzük 37 C° hőmérsékleten. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk a reakcióelegyet, és az etanollal kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat 200 pi alábbi összetételű pufferban oldjuk: 300 mmól nátrium-klorid, 30 mmól nátrium-acetát, pH = 4,25, 1 mmól cink-klorid, literenként. 200 egység Sl-nukleáz. (Miles Laboratories.) Ez egyszálú dezoxi-ribonukleinsavakat hasít. 1 órán át 15 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a reakciót fenol és kloroform elegyével végzett extrakcióval és etanolos kicsapással állítjuk le. A plazmidról így eltávolitottuk az egyszálú HindlII enzimmel előállított végeket. A terméket 10 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligáz pufferban oldjuk, amelyhez előzőleg 20 pikomól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3\ Collaborative Research) adtunk, majd a reakcióelegyet 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki. 16 órán át 4 C° hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd ligáz inaktiválására 10 percen át 65 C° hőmérsékleten tartjuk. Az elegyet BamHI pufferral r, 10 16 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65
