197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
9 197349 10 nyegesebb tulajdonsága annak elhelyezkedése. Ennek a lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia 3’-végétól és az 5’-nemtranszlatált szakasztól jobbra kell esnie, és kapcsolatban kell lennie ezzel egy transzlációs start kodonon keresztül. A találmány szerinti vektorokban a lipoproteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia egy részének sem szabad az ó'-nem-transzlatált szakasz és a külső eredetű proteint meghatározó szekvencia közé esnie. A találmány szerinti vektorok második kivitelezési változatára jellemzően, egy ötödik elem kapcsolódik, ily módon a transzlációs kodont egy enterokináz hasítási helyet meghatározó nukleotid-szekvencia követi, amelyhez, közbeeső rész nélkül, a külső eredetű proteint leíró szekvencia kapcsolódik. Az előzőekben megadott hasítási hely aminosav-szekvenciáját felismeri és karboxil-terminális végén hasítja az enterokináz enzim. Az enterokinázzal hasítható aminosav-szekvenciát meghatározó nukleotid-szekvencia 5’-végén hozzákapcsolódik a transzlációs start kodonhoz, és 3’-végén pedig egy olyan nukleotid-szekvencia 5’-véghez, amely a külső eredetű proteint határozza meg, ily módon a kapott transzlációs termék (metionin) - (enterokináz hasítási hely) - (külső eredetű protein); ez enterokinázzal kezelve érett külső eredetű proteinné hasad. Az enterokináz (3. 4. 21. 9) .egyik, a duodenum membránhoz kapcsolt számtalan hidroláz egyikének' [Liepnieks Light, J. Bioi. Chem. 254, 1677-1683 (1971)] izolálását és tisztítását több közleményben ismertetik, például Liepnieks (lásd előbb) Maroux és munkatársai [J. Bioi. Chem., 246, 5031-5039 (1971)] és Baratti és munkatársai [Biochimica et Biophysica Acta, 315, 147-161 (1973)] közleményei. Az enterokináz a peptidet egy lizin (Lys) karboxilcsoportjánál hasítja, amelyet több aminosav előz meg, azaz glutaminsav (glu) és/vagy aszparaginsav (Asp). így Light és munkatársai [Anal. Biochem., 106, 199-206 (1980)] több olyan aminosav-szekvenciát közölnek, amelyeket az enterokináz felismer. Ilyenek például az alábbiak: Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, Phe-Pro-Ile-Glu-Glu-Asp-Lys, Leu-Pro-Leu-Glu-Asp-Asp-Lys, Ala-Asp-Asp-Lys, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, és mások. A találmány szerinti klónozó vektorokban bármely fenti és más szekvenciákat meghatározó nukleotid-szekvencia jelen lehet. Az egyetlen igény az, hogy olyan legyen ez a nukleotid-szekvencia, hogy az általa kódolt aminosav-szekvencia felismerhető legyen, vagy, ha egy hosszabb láncú pepiidben van jelen, hasítható legyen karboxil-terminális végén enterokinázzal. 6 A fenti igényeket kielégítő vektorok előállítása során az E. coli lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia S'-nem-transzlatált régiójában jelenlévő egyetlen Xbal helyet használjuk ki. Az Xbal hely hasításakor az 5'-nem-transzlatált szakasz egy része kihasad. Oligonukleotid-szintézissel előállíthatunk egy olyan linkért, amely tartalmazza az 5’-nem-transzlatált régió eltávolított részét, amelyhez egy strart kodont meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát kötünk, vagy a start kodont követően az enterokinázzal hasítható helyet és a külső eredetű protein egy részét vagy egészét meghatározó szekvenciát. A külső eredetű proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát előállíthatjuk szintetikusan, azaz az ismert foszfo-triészter-módszert vagy más, jól ismert technikát használva, de előállíthatjuk ezt a dezoxiribonukleinsav-szekvéneiét ismert módon izolált mRNS másolatként is. Az előállított cDNS másolat szükség esetén a start kodonhoz közeleső ponton lévő restrikciós helyen hasíthatjuk. A találmány szerinti klónozó vektorok előállításának egyik kiviteli változata szerint előállítunk egy olyan linkért, amely áll az Xbal hasitási reakció sorén eltávolitott lipoprotein 5’-nem-trariszlatált szakasz egy részéből, ezután következik a start kodont is magába foglaló, külső eredetű protein hasított része. Az előállítást szintetikus módszerrel végezzük. A találmány szerinti klónozó vektorok előállításának egy második kivitelezési változata szerint szintetikusan előállítjuk azt a linkért, amely tartalmazza az Xbal enzimmel kihasított lipoprotein 5'-nem-transzlatált fragmenst, és ezután elhelyezkedve pedig a start kodont, az enterokináz hasítási helyet és a külső eredetű protein hasított részét. Ezeket a hiányzó részeket pótolni képes linkereket a lipoprotein kifejeződését szabályozó szekvencia többi rendelkezésre álló elemé. vei összekapcsoljuk, amiután vektort kapunk. A találmány szerinti eljárással előállított klónozó vektorokat felhasználhatjuk több külső eredetű protein előállítására, többek között emlős és humán hormonok, enzimek és : immunogén proteinek (vagy ezek intermedier jeinek) előállítására. Ilyen termék például az inzulin A lánca, az inzulin B lánca, a proinzulin, az interferon, a növekedési hormon, & száj és körömfájás antigén proteinjei, a ! szomatosztatin, a ß-endorfin és mások. Előnyösek azok a klónozó vektorok, amelyek a humán növekedési hormont vagy a marha növekedési hormonét termelik. A találmány szerinti eljárás első kivitelezési változata sze( rint előállított klónozó vektorok természetesen amino-terminális végükön metionint tartalmaznak a start kodon jelenléte miatt. A második kivitelezési változat szerint előállított vektorok kifejeződő termékei metionint I (start kodon), enterokináz hasitási helyet és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 55
