197349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési hormonok kifejezésére használható klónozó vektorok előállítására
7 197349 8 szerepelnek minden esetben, azaz a promoter régió és az 5*-nem-transzlatált szakasz. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikák használatakor általános, hogy egy külső eredetű protein előállítására a proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát egy klónozó vektor kifejezést szabályozó szekvenciájába építjük be egy olyan ponton, hogy a termék hibrid proteinből álljon. Hibrid protein alatt olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav által meghatározott terméket értünk, amely áll egy természetes (endogén), a kifejeződést szabályozó szekvencia által meghatározott protein egészéből vagy annak egy részéből (esetünkben a lipoprotein), amelyhez kapcsolódik az idegen (exogén) protein. A megfelelően tervezett hibrid protein az endogén proteinrészt és az idegen proteint elválasztó szakaszon hasítási helyet tartalmaz. A hasitási hely révén érett exogén protein termékhez jutunk a hibrid protein kémiai vagy enzimatikus kezelésével. Ahogy azt az előzőekben már megadtuk, külső eredetű proteinek kifejezésére felhasználható az lpp kifejeződését szabályozó szekvencia. A közelmúltban azonban felfedezték, hogy az lpp kifejeződését szabályozó szekvencia igen előnyösen használható fel exogén proteinek kifejezésére abban az esetben, ha a molekulát úgy állítjuk össze, hogy a dezoxi-ribonukleinsav-szegmens tandem elhelyezkedésében hordozza a lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia promoterét és ő’-nem-transzlatált szakaszát, és egy transzlációs start kodont, amiután, anélkül, hogy endogén proteint meghatározó nukleotid-szekvencia vagy szekvencia-rész következne, exogén proteint meghatározó szekvencia vagy egy enterokináz hasítási helyet kódoló nukleotid-szekvencia következik, amelyhez megszakítás nélkül kapcsolódik az exogén proteint leíró szekvencia. Ez nem azonos a lipoproteint vagy ennek egy részét és exogén proteint tartalmazó hibrid proteinnel. A találmány szerinti klónozó hordozók előállításához több elemre van szükség. Kettő a szükséges elemek közül a klónozó vektorok előállításakor általánosan használt. Először is, a vektornak tartalmaznia kell egy funkcionális replikációs origót tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst, ez a replikon. A plazmidok és fág dezoxi-ribonukleinsavak természetükből következően tartalmaznak gazdasejtben replikációt biztosító replikonokat. Másodszor, a vektornak rendelkeznie kell egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmenssel. amely transzformálható gazdasejtbe egy olyan tulajdonságot juttat, amely lehetővé teszi a nem-transzformált sejtek szelekcióját a transzformált sejtek közül. Több tulajdonságot használhatunk szelekciós célokra. Az egyik leggyakrabban használt tulajdonság az antibiotikum rezisztencia, például a tetraciklinnel vagy ampicilinnel szembeni rezisztencia. Az előzőekben ismertetett két elem általában jelen van, és felismerhető a klónozó vektorokban. Ilyen vektorok például a baktérium plazmidok, mint például az E. coli plazmidjai, köztük a pBR322, pMB89, ColEl, pCRl; szélesebb gazda-specificitású plazmidok, például az RP4; fág dezoxi-ribonukleinsavak, mint például a lambda és mások. A legtöbb, de talán az összes fentiekben tett vektor eleve tartalmazza a megadott két elemet. A találmány szerinti specifikus vektorok harmadik eleme a lipoprotein kifejezősdését szabályozó szekvencia. Az E. coli lipoproteint kifejező szabályozó szekvencia jelen van a pKENlll plazmidban, és E. coli CC620 sejtekben szaporítható. A tenyészetet az alábbi állandó törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61 634. Innen az NRRL 15 011 sorszámon rendelhető meg. A lipoprotein kifejeződését szabályozó szekvencia kihasítható a pKENlllből az ismert restrikciós helyeket és az ezeknek megfelelő restrikciós endonukleázokat felhasználva. Több más lipoprotein kifejeződést szabályozó szekvencia is rendelkezésünkre áll, ezeket ismert módszerekkel használjuk. Ezek a módszerek tartalmazzák például a szintézissel való előállítást vagy megfelelő lpp-szekvenciákat felhasználva egy próbával való izolálást (például pKENlll), és az lpp-szekvenciák között fennálló nagyfokú homológiát felhasználva, ezekkel a próbákkal hibridizációval szelektáljuk a más forrásokból származó lpp-szekvenciát. Rutin módszereket használva állitjuk elő az előnyös klónozó vektrorokat a lipoproteint kifejeződést szabályozó szekvencia beépítésével. A klónozó vektorokban különböző helyek léteznek, amelyekbe erre a helyre specifikus restrikciós endonukleázt használva belehasitunk. Bármely ilyen helyet kiválaszthatunk a lipoproteint kifejező szabályozó szekvencia beépítésére. Például a jól ismert és jól dokumentált pBR322 plazmidon több megfelelő restrikciós hely létezik, ezek bármelyikét felhasználhatjuk beépítési helyként. A ß-laktatna z génen belül egy PstI hely létezik. A specifikus kódoló szakaszokon kívül eső más helyek az EcoRI és PvuII. Ezeket és más helyeket a témában jártas szakemberek felismerik. Ezen helyeket vagy másokat felhasználva a lipoprotein kifejeződést meghatározó szekvenciát vagy ennek alapvető fontosságú részét könnyen beépíthetjük a jelen leírásban megadott vektorok előállítása érdekében. A negyedik elem, amely a találmány szerinti vektorokra továbbá jellemző, egy külső eredetű proteint kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia. A találmány szerinti vektorokban lévő külső eredetű proteint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia leglé-5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
