197348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására
6 197348 7 egyéb adatokból valószínűsíthető hexanukleotid kombinációk előfordulási helyeit kerestük ki, és az így kapott számitógépes térképeket összevetettük a valódi térképpel, melyet az SV40 DNS molekulán biokémiai, enzimatikus módszerekkel határoztunk meg. így az enzim vágási felismerő helyei azokban a szekvenciákban voltak lokalizálhatok, ahol a számítógép az 5-ATGCAT-hexanukleotidot felismerte. A felismerő helyen belül a metszés pontos lokalizációját is meghatároztuk. Az 1-es típusú adenovirus DNS-nak a PstI restrikciós enzimmel vágott terminális fragmentumait T4 ligáz segítségével ligáltuk a találmány szerinti enzimkészítménnyel hasított adenovirus DNS terminális fragmentumokkal. A kétféle fragmentum ligálható volt, ami csak akkor lehetséges, ha a találmány szerinti enzim és a PstI restrikciós endonukleáz azonos szerkezetű, komplementer ragadós végeket produkál. (A szimmetrikusan hasított, végig dupla szálú, ún. .blunt end' ligálás lehetőségét kizártuk). Tekintve, hogy a PstI enzim felismerő szekvenciájában a belső négy nukieotid azonos az általunk izolált restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciájának belső négy nukleotidjával, és ismert, hogy a PstI endonukleáz által produkált fragmentumok végei 3’ túlnyúló (extenziós) egyszálú szerkezetűek, PstI: 5-CTGCAG .V Str. mutans .c" I enzim (SmucI): 5- -ATGCAT 3’ így a ligálhatóság azt bizonyítja, hogy a találmányban szereplő enzim (SmucI) is 3* túlnyúló egyszálú végeket hasít. A metszés pontos lokalizációja tehát a felismerő szekvencia ötödik adeninje és hatodik liminje közé helyezhető el: 5-ATGCAT 3’ A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) A deponált Streptococcus mutans .c" szerotipusú izolátum enzimtartalma rendkívül magas. b) Az eljárás során az enzim nagyon stabil. Bármely tisztítási lépés után a termék hetekig tárolható +4 °C-on minimális veszteségekkel. A más fajtájú enzimek ezen idő alatt teljesen elbomlanak. (1 hónap után az eredeti aktivitás 70-80%-a marad meg.) c) A baktériumban lévő magas enzimlartalom és a kevés, könnyen leválasztható szennyező nukleáz következtében az eljárásban kevés egyszerű tisztítási lépést alkalmazunk, nagy aktivitású, magas tisztaságú enzimkészítmény előállítására. d) Az eljárás olyan enzim terméket eredményez, mely új felismerő specifitással rendelkezik. Az Ava III izoskizomer bonyolult termelése és nehéz tisztíthatósága miatt nem hozzáférhető. A legújabban megismert, másik említett izoskizomérrel, az Nsil-el szemben viszont a találmány tárgyát képező enzim olcsóbb előállithatósága és nagyobb stabilitása jelent előnyt. e) A találmány szerinti enzim felismerő szekvenciájának tulajdonságai folytán a nagy specificitású csoportba sorolható, Így tehát egy gén átlag méretének megfelelő DNS darabokat vág. Ezek a fragmentumok az általánosan használt klónozó vektor plazmid, a pBR322 PstI hasítási helyére beépíthetők és ligálhatók. A találmány szerinti eljárást a következő kiviteli példán mulatjuk be: 1. példa A Streptococcus mutans .c' szerotípus -20 °C-on tárolt 50% glicerines szuszpenziójából leoltottunk 50 ml szív-agy kivonat táptalajt (Difco, USA utasításai szerint elkészítve és sterilezve). Rázás nélkül tenyésztettük 24 órán keresztül 37 °C-on, majd az egészet egy 3 literes Erlenmeyer lombikban lévő 2 liter sziv-agy kivonat táptalajba átoltottuk. A tenyésztést 37 "C-on, aerob módon, rázás nélkül végeztük, és az 550 nm-en mért optikai sűrűséget ellenőriztük. A tenyészet a növekedés logarilmusos fázisának végét 0,9 egységnél érte el, ekkor jégfürdőben lehűtöltük, majd +1 C“-on 10 000 g-vel 20 percen keresztül a baktériumsejteket ülepítettük és 10 inM TrislICl (pH 8); 7 mH 2-merkapto-etanol; 1 mM EDTA pufferrel mostuk. Az így kapott kb. 2 g baktériumsejt masszát szuszpendáltuk 2 ml 20 mM TrisHCl (pH 8), 7 mM 2-merkapto-etanol összetételű pufferben, majd az MSE ultrahangos készülékkel összesen 25-ször 30 másodperces impulzusokkal jégfürdőben feltártuk, az impulzusok között egy perces hűtési szüneteket tartottunk. A szuszpenzióhoz ekkor 1% végkoncentrációra beállítva Triton XI00 detergenst kevertünk. A feltárt szuszpenziót ezután Janetzky VÁC 602 ultracentrifugával ülepítettük, +4 °C-on, 30 000 fordulatszámmal 60 percig (100 000 g). A 2 ml felülúszót gélszűréssel tisztítottuk tovább. Egy 1,5 cin2 x 80 cm méretű, Sephadex G200 (Pharmacia) gél szemcsékkel töltött, és 1 M NaCI; 10 mM TrisHCl pH = 8, 7 mM 2- -merkapto-etanol pufferrel egyensúlyig telített. oszlopra vittük az ultracentrifugált felül úszót. 5 ml/óra átfolyási sebességgel eluáltunk. Egy ml-es frakciókat gyűjtöttünk, az enzimaktivitásokat teszteltük, az aktiv frakciókat egyesítettük,, majd 1 mM foszfát puffer (pH 7,4) hozzáadása után hidroxilapatit oszlopon (1,5 cm2 x 5 cm) kötöttük az enzimet. Az oszlop előzetes telítéséhez, majd az anyag-felvitelt, követő mosáshoz 1 mM foszfátot és 7 mM 2-morkapLo-etanolt tartalmazó puffert 5 ml/óra átfolyási sebességgel használtunk. Ezután az oszlopról az enzimet, öszszesen 20 ml, 1 ínM-tól 400 mM-ig terjedő foszfát puffergrudionssel eluáltuk. Az enzim 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
