197348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására
8 197348 9 100 mM és 180 uiM foszfát-koricenlráció között oldódott le az oszlopról. Az aktiv frakciókat egyesítettük, majd jégben hűtve, lassan keverve hozzáadtunk annyi telített (pH 8) ammónium-szulfát oldatot, hogy az enzimkészítmény 25%-os (NHíhSOí telitódésű legyen, majd egy órán át keresztül kevertük jégfürdőben. A keletkezett csapadékot Janetzky K 24 centrifugával +4 °C-on, 14 000 fordulatszámmal centrifugáljuk 30 percig. A felülúszót végül hidrofób kroinatográfiával tisztítottuk, Phenyl Sepharose (Pharmacia) oszlopon (1,5 cin2 x 15 cm), melyet előzőleg 25% ammónium-szulfát; 10 mM TrisHCl (pH 8); 7 mM 2-merkapto-etanol oldatttal mostunk. A nem kötődött anyagok kimosását is ezzel a pufferrel végeztük. Az enzimet az oszlopról 25%-tól 0%-ig csökkenő ammónium-szulfát gradienssel eluáltuk, 10 mM TrisHCl (pH 8) 7 mM 2-merkapto-etanolt tartalmazó pufferben. Az aktiv frakciók egyesítése után dialízis és koncentrálás történt 50% glicerin; 10 mM TrisHCl (pH 8), 7 mM 2-merkapto-etanol oldattal szemben, +4 °C-on 12 órán keresztül. Az enzimkészitmény így -20 °C-on tárolható. A kitermelés mintegy 60%-os (20 000 egység enzimaktivitás 2 g sejtből). 2. példa Streptococcus mutans „c" szerotipusű törzsének -20 °C-on tárolt 50% glicerines szuszpenziójából leoltottunk 50 ml szív-agy kivonat táptalajt. 37 °C-on 24 órán keresztül tenyésztettük, majd az egészet háromliteres Erlenmeyer-lombikban lévő 2 liter táptalajba átoltottuk, mely a következő összetételű volt: 1,1% húskivonat (Bouillon portáptalaj, Humán, Magyarország); 1% élesztő-kivonat (Baclo Yeast Extract, Difco cég, USA). A táptalaj pH-ját 7,6-ra állítottuk, majd autoklávban sterileztük. A tenyészet ennél a táptalajnál az 550 nm-nél mért 0,5 optikai denzitás egység körül érte el a logaritmusos fázis végét. Ekkor a tenyészetet jégbe hűtöttük, és a továbbiakban az 1. példában megadott módon jártunk el. 3. példa A baktérium termelése és a sejtmassza ultrahangos feltárása az 1. példában megadott módon történt. A Tritonos kezelés után azonban 200 mikrogramm/ml RNázét adtunk a szuszpenzióhoz és jégfürdőben tartottuk 30 percig, majd 0,5 g aktivált foszfocellulóz por Rajz hozzáadása után 20 percig kevertük jégfürdőben. Ezután az ultracentrifugálás, a Sephadex G 200 és a hidroxilapatít kromatográfia 5 az 1. példában megadott módon lett végrehajtva. Befejező lépésként DEAE cellulóz oszlopig romatog ráfiál alkalmaztunk. Egy előzőleg 10 mM TrisHCl (pH 8), 7 mM 2-merkapto-elanőit pufferrel mosott DEAE cellulóz oszlopon (1,5 cm2 x 5 cm) engedtük át az előző hidroxilapatit kromatográfia aktív frakcióit, 5 ml/óra sebességgel. Az oszlop fenti pufferrel történő mosása után az enzimet 40 ml, 0- -tói 1 M-ig emelkedő nátrium-klór id pufferrel eluáltuk. Az aktivitást a 0,4 M és 0,8 M közötti frakciókban volt kimutatható. Az aktiv frakciók egyesítése, dialízise és tárolása az 1. példa szerint történik. 20 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 5’ ATGCAT-specifikus rest- 25 rikciós emlőnekleúz előállítására fermentálással azzal jellemezve, hogy Streptococcus mutáns baktérium .c" szerotipusű törzsét (az Országos Közegészségügyi Intézetben, a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében 30 00 338 számon letétbe helyezve) alkalmas táptalajon tenyésztjük, majd a fermentléből az enzimet tartalmazó sejttömeget ismert módon elkülönítjük és feltárjuk, majd az enzimet tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1986.01.16.) 35 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a törzs tenyésztésére azzal jellemezve, hogy a tenyésztést aerob körülmények között végezzük. (Elsőbbsége: 1986.01.16.) 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a 40 törzs tenyésztésére azzal jellemezve, hogy a táptalajként szív-agy kivonatot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.01.16.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás a törzs tenyésztésére azzal jellemezve, hogy a 45 táptalajként élesztő és húskivonat táptalajt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.01.16.) 5 Az 1. igénypont szerinti eljárás az enzim tisztítására azzal jellemezve, hogy a baktériumsejtek bői az enzimet ultrahangos 50 feltárás után Triton X100 hozzáadásával tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1986.01.16.) 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az enzim tisztítására azzal jellemezve, hoy a feltárt enzimet RNáze-vel ke- 5_ zeljük, az RNS-szennyezéstől mentesített nyers enzimet foszfocellulóz és DEAE cellulóz ioncserélő kroinatográfiával kezelve a szenyriyező nwkleázokat. eltávolítjuk. (Elsőbbsége: 1987.09.08.) nélkül A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 6 90.2043.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkő István vezérigazgató
