197348. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-ATGCAT-specifikus restrikciós endonukleáz előállítására
4 197348 5 10 mM TrisHCl (trisz-hidroxi-metil-amino-metén), pH 8,1 mM EDTA (etilén-diamin-tetraacetát) és 7 mM 2-merkapto-etanol oldallal mostuk. Ez a baktériumsejt tömeg -20 °C-on befagyasztva korlátlanul és enzim-veszteség nélkül tárolható, vagy azonnal felhasználható az enzim feltárására. Az enzim feltárásra során 2 g nedves súlyú sejtet 2 ml olyan pufferban szuszpendáltunk, amelynek összetétele: 20 mM TrisHCl (pH8), 7 mM 2-merkapto-etanol. A sejtfeltárást ultrahangos dezintográtorral jégfürdőben végeztük. A 10 másodperces impulzusokat 1 perces szünet követte- igy a a feltárást addig végeztük, amíg a szuszpenzió optikai denzitása az eredeti érték 10%-a alá csökkent. Ez többnyire 20-25 impulzus alkalmazása után bekövetkezett. így a szuszpenzióban már elegendő enzimaktivitás szabadult fel. A hozam növelhető Triton X 100 (Fluka cég, Svájc) nem-ionos detergens hozzáadásával, 0,05% és 2% közötti, előnyösen 1% végkoncentrációra beállítva a szuszpenziót. Ez után az alternatív eljárásban az RNS-ek eltávolítása céljából RNázét (Reanal) adtunk a szuszpenzióhoz, 200 mikrogranim/ml koncentrációban és 0 °C-on 30 percig kevertük. A következőkben foszfocellulóz porral (Whatman P 11), melyet a szokásos módon aktiváltunk, 20 percig 0 °C-on keverve kivontuk a nemspecifikus nukleázok nagy részét. A lényegében enzimtől mentesített sejttörmelék eltávolítására ullracentiifugálást alkalmaztunk, (100 000 g, 60 perc). Vizsgálataink szerint kisebb ülepítési sebesség is kielégítő (Janetzky K24 centrifuga, +4 °C 14 000 fordulatszám, 60 perc). A 2 ml térfogatú folülúszóból ezután gélszűréses kromatografiával az enzimet első lépésben tisztítottuk. A Sephadex G 200 vágj Sephadex 6 D (Pharmacia svéd cég) gélszemcsékkel töltött oszlopon a kromatográfiai, olyan pufferben végeztük, amelynek összetétele: 20 mM TrisHCl (pH = 8). 7 mM 2-merkapto-etanol és 1 M nátrium-klorid volt. Az áramoltatást perisztaltikus pumpával 5 ml/óra átfolyási sebességei végeztük. Az aktív frakciókat egyesítettük, majd az enzim további tisztítását hidroxilapatit (Bio-Rad gyártmány, USA) kromatográfiával végeztük. A hidroxilapatit oszlopot 1 mM nátrium kálium-foszfátot (pH 7,4) és 7 mM 2-inerkapto-etanolt tartalmazó pufferrel mostuk, majd az egyesitett aktív frakciókat úgy engedtük az oszlopra, hogy előtte hozzáadtunk 1 mM foszfát-puffért. Az anyagfelvitel után az oszlopot 7 mM 2-merkapto-etanolt tartalmazó 1 mM-tól 400 mM-ig emelkedő foszfát gradienssel eluáltuk és az aktiv frakciókat egyesítettük. Az enzim tisztítás második lépésében az egyesített aktív frakciókból ammónium-szulfáttal a maradék szennyező nukleázokat kicsaptuk. Az enzim készítményhez ammónium-szulfát telített, pH = 8-ra állított oldatából 4 annjit kevertünk lassan jégbe hűtve, hogy 25%-os (NIU)zS04 telítettségű oldatot kapjunk, majd jégfürdőben kevertük 60 percen keresztül. Ezután a csapadékot Janetzky K 24 centrifugával ülepítettük (+4 °C-on, 11 000 fordulatszámmal, 30 percig). A felülúszót végül égj' előzőleg 25% mértékben lelit.ell ammóniuin-szulfál oldattal kezelt Phenyl-Sepharose oszlopon kromatografálluk, az oszlopon megkötött enzimet csökkentő ammóiiium-szulfát gradienssel eluáltuk. Az alternatív eljárásban a hidroxilapatit kromalográfia után DEAE cellulóz (Whatman DE52) kroamatografiát használtunk. Az oszlopon előzetesen 10 mM TrisHCl (pH 8), 1 mM 2-merkapto-etanol pufferrel kezeltük, majd az előző aktív frakciók átengedése után mostuk ugyanezzel a pufferrel. Az enzimet 0-t.ól 1 M-ig emelkedő NaCl gradienssel eluáltuk. Az enzimet tartalmazó aktív frakciókat egyesítettük, majd dializáltuk (és egyben koncentráltuk) 50% glicerint tartalmazó 10 mM TrisHCl (pH 8) és 7 mM 2-merkaplo-etanol pufferrel szemben. Az igy kapott enzimkészítniény -20 °C-on tarolható. Az enzimkészilmény az előállított tisztasági fokban megfelel a DNS vizsgálatokban és a génsebészetben alkalmazott restrikciós enzimekkel szemben támasztól követelményeknek: vagyis nem tartalmaz egyéb specifikus nukleá/t, nem-sx>ecifikus nukleázokat és nukleolidáz vagy foszfatáz szennyezés sem mutatható ki benne. Az enzimkészítmény specifikus és nemspecifikus nukleázoktól való mentességét azzal bizonyítottuk, hogy lambda DNS-böl vagy adenovirus-DNS-ből az enzimkészítménnyel végzett fragmentum sorozat még 50-szeres enzim túladagoláskor, több órán keresztül emésztve sem mutat új fragmentum megjelenést, vagy a fragmentumok exonukleázos bomlására utaló elkenődést. Az exonukleázok és nukleotidázok hiányát bizonyítja, hogy izotóppal jelölt natív vagy emésztett PM2 fág DNS-ből a fenti körülménjrek között emésztve a rádióaktivitásnak kisebb mint 0,1%-a alakul át savoldhatóva (a nukleotidokra való bomlás indikátora). A foszfatáz szennyezést egy kromogén szubsztrát, a nitro-fenil-foszfát bomlásának hiányával spektrofotometriás méréssel zártuk ki. A vizsgálatok során az enzimaktivitás mérésére titrálásos módszert használtunk (Roberts et al. J. Mól. Bioi 91., 121-3. 1975.). Az enzim hígításával meghatározható az a legkisebb enzim mennyiség, amely 60 perc alatt 1 mikrogramm lambda fág DNS-el komplett emésztési ad, standard körülmények között. (25 mM TrisHCl (pH = 7,5); 10 mM magnézium-klorid; 10 mM 2-merkapto-etanol; 150 mM nátrium-klorid, 37 °C) Az enzim felismerő, vágási specificitásét számítógépes módszerrel határoztuk meg. A szémitógép memóriájában lévő teljes SV40 vírus DNS nukleolid sorrendben különböző, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
