197212. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírus- és daganatellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására

23

197212

24

A D609 vegyület vírusellenes hatása különböző adjuváns vegyületekkel kombinációban pH=7,4 értéken

9. táblázat

A vegyület neve Szerkezete Gátlási faktor

vírusellenes hatás“ sejttoxitásb

Undekánsav

CH3(CHz)sC00H

5.8xl03

1.6

Nátrium-dezoxikolát

C23H39O2CO0Na

l.OxlO3

1.2

Nátrium-dodecilszulfát

CH3(CH2)n0S03Na

7.2xl03

1.6

Dodecil-foszfát

CH3(CH2)ii0P03Hz

10.4

n.d.

Dodecil-foszfonsav

Dodecil-trimetil-ammónium-CH3(CH2)uP03H2

2.8

1.4-bromid (TNCB)

CH3(CH2)uN(CH3)3+Br-15

1.6

Két párhuzamos kísérletben HSV-l-el fertőzött Rita sejttenyészeteket külön-külőn az adszorpciós időszak (1 óra) után 23 órán át 10 ng/D609 vegyülettel és 40 jug/ml detergens szerrel kezeltünk. A vírus-szaporulatot két párhuzamos plakk-vizsgálattal határoztuk meg, és a kezeletlen tenyészet esetén kapott hozammal hasonlítottuk össze. A vírusellenes hatást a virushozam gátlásának faktorával fejeztük ki.

Fertőzetlen Rita sejteket két kísérletben a fenti módon kezeltünk, majd a sejtszámot Neubauer kamrával meghatároztuk. A kezeletlen és kezelt tenyészetek esetén kapott értékek arányát (a két kísérlet átlagaként) adtuk meg.

További bizonyítékok a HTLV-III virus

DEXA/undekánsav kombinációval kapott

gátlására vonatkozóan 30

HTLV-III vírus reprodukciójához K37 (humán T-sejt limfóma)-sejteket használtunk.

A HTLV-III-mal fertőzött K37-sejteket a fertőzés után 3 vagy 5 napon át, 10 Mg DEXA 35 és 10 Mg undekánsav/ml vegyületekkel kezeltük. Ilyen körülmények között a K37-sejtek még növekedtek, amelyet a kezelés kezdete előtti és a végén meghatározott sejtszámból (vitális festés utón) állapítottunk meg. To- 40 vábbé, ugyanannyi celluláris m RNS-t (.Northern Biot') találtunk a kezelt és kezeletlen sejtekben is.

Egyidejűleg DNS-t is elkülönítettünk a fentiek szerinti kezelt, illetve kezeletlen K37- 45-sejttenyészetekből, és 32P-vel jelzett klónozott autentikus HTLV III-DNS-sel hibridizáltuk, majd az eredményeket autoradiográfiával határoztuk meg. A HTLV Ill-virus replikációs intermediere - miként valamennyi retrovirus 50 esetében is - a szuperhelikólis DNS. Mind ez (I-es forma), mind a nyújtott (relaxált) Il-es forma a kezeletlen tenyészetek esetében mind .

3, mind pedig 5 nap múlva, az autoradiogramon fekete foltokként megfigyelhető (1. 5b 55 és d ábrák). Egy egyszeresen vágó restrikciós enzimmel - mely az annuláris DNS-t egységnyi hosszúságú lineáris DNS-sé alakítja át - végzett vágás után 3 és 5 nap múlva ismét a jellegzetes jeleket kaptuk (5f és h 60 ábrák). A kezelt kultúrák esetében azonban 3 vagy 5 nap múlva sem a szuperhelikólis DNS-t (5a és c ábrák), sem pedig a vágás után a lineáris DNS-t (5e és f ábrák) nem tudtuk kimutatni. 65

így az eredményekből kitűnik, hogy a DEXA/undekánsav kombinációs kezelés a HTLV III virus replikációját teljesen gátolja.

A fentiekben ismertetett gátló hatás a K37-sejtekben olyan koncentrációban valósul meg, amely a fertőzetlen K37-sejtek toxikus károsodását nem okozza, és csak magasabb koncentrációban következik be szelektív károsodás nemcsak a K37-T-limfóma sejtekben, hanem más humán T- és B-limfómák esetében is, miként az a 8. ábrából kitűnik. A DEXA//undekánsav kombináció mindazonáltal a mi— togérnel stimulált humán perifériás limfocitákat (pBL) nem károsítja olyan koncentrációkban, amelyek a daganatsejtekre szelektiv módon pusztitóan hatnának.

A kísérletet a következőképpen végeztük. Perifériás vér limfocitákat limfoprep gradiensen centrifugólással különítettünk el. A sejteket 10% fótális borjú szérummal és 5 Mg/'ml növényi agglutinint (PHA) tartalmazó RPMI 1640 táptalajon inkubáltuk. 1 nap múlva a sejteket centrifugólással gömböcskékké alakítottuk és mikrotiter lemezekre (2xl05 sejt üregenként) olyan új táptalajra helyeztük, amely PHA-t nem, viszont 10% interleukin-2-t tartalmazott. Ezután DEXA-t és növekvő koncentrációban a 8. ábrán bemutatott módon undekánsavat adtunk hozzá. Ezzel párhuzamosan T-sejt limfómákat (Jurkat és K37), valamint B-sjet limfómákat (Raji és P3HR1) kezeltünk ugyanilyen módon. 4 napos inkubáció után az élő sejtek számét szín-kiszoritási technikával (tripén kékkel) határoztuk meg. A Jurkat-, Raji- és K37-tenyészetekben - amelyeket 5 Mg DEXA-val és 40 Mg/ml undekánsavval kezeltük - élő sejteket nem találtunk. Ezzel szemben a kezelt

13