197212. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vírus- és daganatellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására
21 197212 22 nőstény Balb-c egereket 1x10® Meth-A-daganatsejtekkel i.p. kezeléssel fertőztünk meg. A transzplantáció után 5 nappal tíz állatot naponta kétszer 50 mg/kg D609, 50 mg/kg kálium-undekanoát vegyülctekel és 25 U inzulin/kg-ot tartalmazó izotóriiás glükóz oldattal kezeltünk. Az anyagokat 1 ml/20 testsúly g oldatban oldottuk. Kontroll csoportként tiz állatot nem kezeltünk. A kezelt csoportból (üres körök) két állat több, mint 65 napon át maradt életben. A fenti vizsgálatokban az inzulint azért adagoltuk, hogy biztosítottuk az állati szervezet számára az egyik olyan növekedési tényezőt, amely a glükóz-termelés növekedéséhez és a sejt-növekedés, -szaporodás fokozásához, valamint a megfelelő működéshez szükséges. A 8. ábrán az egészséges vér limfociták, valamint a T- és B-sejt-limfómák D609/undekánsav kombinációval szemben mutatott érzékenységét mutatjuk be. Perifériás vér-limfocitákat (pBL) limphoprep gradiensen centrifugálással elkülönítettünk, majd a sejteket 10% szarvasmarha fötális borjú szérummal és 5 pg/ml növényi agglutininnel (PHA) kiegészített RPMI 1640 táptalajon inkubáltuk. 1 nap múlva a sejteket centrifugálással elkülönítettük és ún. mikrotiter lemezekre (bemélyedésként 2xl05 sejt) helyeztük, majd PHA-t nem, de interleukin-2 (IL-2) kiegészítőt tartalmazó táptalajt adtunk hozzá. Az ábrán bemutatott módon D609-et és növekvő koncentrációban undekánsavat adagoltunk. Ezzel párhuzamosan két T-sejt limfómát (Jurkat és K37), valamint két B-sejt limfómát (Raji és P3HR1) ugyanis kezeltünk. Az inkubáció után 4 nappal gyanta-kiszoritásos módszerrel (tripán kéket használtunk) mindegyik mélyedésben meghatároztuk az élő sejtek számát. Az 5 pg D609 vegyülettel és 40 pg/ml undekánsavval kezelt Jurkat, Raji és K37 sejttenyészetekben nem tudtunk élő sejteket kimutatni. A humán perifériás vér-limfociták azonban - bár ugyanigy kezeltük azokat is - mitotikus osztódó képességüket megőrizték. A D609/undekánsav és D609/dodecil-trimetil-ammónium-bromid kombinációk vírusellenes hatását 7,4-es pH-értéken hasonlítottuk össze. Az eredményeket az alábbiakban foglaljuk össze. Vegyület Vírusellenes hatás® Sejttoxicitásb undekánsav (Cl 1) 5.8xl03 1.6 dodecil-trimetilammónium-bromid (TNCB) 15 1.6 “1 Két kísérletben HSV-l-el fertőzött Rita sejteket (MOI=0.01 pfu/sejt) az adszorpciós időszak után 23 órán át 10 pg/ml D609 és vagy 40 pg/ml Cn vagy 20pg//ml TNCB vegyületekkel BME, 5% FBS, 1% penicillin és stroptomycin táptalajon, pH=7,4-en kezeltünk. A vírus-hozamot plakk-vizsgálattal határoztuk meg, és a kezeletlen tenyészet esetében kapott hozammal hasonlítottuk össze. A vírusellenes hatást a virus-titer gátlásának faktorával (a két tenyészet esetén kapott értékek átlagával) fejeztük ki. b> Fertőzetlen Rita-sejteket az a) pontban ismertetett módon kezeltünk, és a sejtszámot Neubauer-féle számláló-kamrával határoztuk meg. A kezeletlen és kezelt tenyészetek hányadosát (a két kísérlet átlagát) a táblázatban adtuk meg. Az eredményekből kitűnik, hogy a kationos adjuváns (TNCB) vegyület az undekánsavhoz (Cn-hez) képest sokkal kisebb specifikus vírusellenes hatással rendelkezik. Jóllehet a vírus- és daganatellenes hatású találmány szerinti xantát vegyületek, különösen a D609 vegyület, esetében, ha azokat egymagukban használjuk, úgy látszik vírusellenes hatásuk 6,8-as pH-értéken nagyobb, mint a kissé magasabb pH=7,25-7,8 értékeken; mégis a találmány szerinti valamilyen ionos adjuvánssal készített kombinációjuk a virus-nővekedést a fiziológiai kb. 7,4- -es pH-értéken hatásosan gátolja. A további kísérletekben, ennek megfelelően, Rita sejttenyészeteket a HSV-l-el végzett fertőzést követően 1 nappal D609 vegyülettel, s azzal egyidejűleg a 9. táblázatban ismertetett adjuváns vegyületek egyikével kezeltünk. (A D609: adjuváns arányt az elökisérletek alapjár. 1:4 arányúnak választottuk.) A vírus-szaporulat hozamát plakk-vizsgálattal határoztuk meg és az értékeket a kezeletlen fertőzött tenyészetek esetében kapott hozamokkal hasonlítottuk össze. A D609 vegyületnek a S. táblázat első három vegyületének bármelyikével készített kombinációjával pH=7,4-en végzett kezeléssel kaptuk a legfeltűnőbb HSV-1 növekedési gátlási eredményeket. A megnővekedett vírusellenes hatást nem tulajdoníthatjuk a fokozott sejttoxicitásnak, mivel az ugyanilyen kezelésnek alávetett fertőzetlen sejtek 62,5-83%-a mitotikus osztódásra képes volt, miként az a táblázatból kitűnik. A táblázatban szereplő utolsó három adjuváns az első három vegyülethez képest minimális vírusellenes hatást mutatott. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12 65
