197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
17 197 047 IQ nukleotid - láncokat kapcsolhatunk mindkét 3’ -véghez. Előnyösen 20-50 dezoxi-nukleotídot kapcsolunk abból a célból, hogy a komplementer dezoxi-nukleolid-láncok révén kialakult kétszálű cDNS-hez stabil kapcsolódási pontot biztosítsunk. Például úgy járunk el, hogy a pBR 322 plazmidot megfelelően pufferezett, vizes, magnézium-kloridot, egy merkaptánt, például 2-merkapto-etanoít és egy vivőproteint, például marhaszérum albumint vagy zselatint tartalmazó reakcióelegyben restrikciós endonukleázzal, például Pst I enzimmel kezeljük. Az emésztés leállítását követően például fenollal proteinmentesítjük az oldatot. A dezoxi-nukleotidi[csoportok terminális kapcsolását ismert, magnézium-kloridot, nátrium-kakodilátot és egy vivőfehérjét, például marhaszérum albumint tartalmazó pufferezett reakcióelegyben végezzük, megfelelő mennyiségű dezoxi-nuklcozid-trifoszfátok, például dGTP és terminális dezoxi-nukleotidil-transzferáz jelenlétében. c) A dezoxi-nukleoüclokkal meghosszabbított, kétszdlú cDNS előállítása A 2b) pontban megadottak szerint előállított kétszálű cDNS meghosszabbítását a linearizált, dezoxi-nukleotidokkal meghosszabbított pBR 322 plazmád előállításához hasonlóan végezzük (lásd 3b/ pont), a dGTP helyett például dCTP komplementer dezoxi-nuklcotid-trifoszfátot használva, és előnyösen olyan reakcióelegyben, amely a magnézium-klorid helyett kobald-kloridot tartalmaz. A kétszálű cDNS-t például nátrium-kakodilátot, kobald-kloridot, egy proteint, például marhaszérum albumint, a megfelelő dezoxi-nukleozid-írifoszfátot, például dCTP-t és terminális - dezoxi - nukleotid il - transzferázt tartalmazó reakcióelegyben inkubáljuk. d) A linearizált, meghosszabbított pBR 322 és a meghosszabbított kétszdlú cDNS összeforrasztdsa A linearizált, meghosszabbított pBR 322 plazmid és a meghosszabbított kétszálű cDNS összeforrasztható és újra körré zárható, ismert módon; az úgynevezett komplementer dezoxi-nukleotid-láucok bázispárosftási módszerével. A körré alakulás elősegítésére és a konkatomerek kialakulásának meggátlására (a különböző lineáris hibrid plazmidok összekapcsolásának gátlására) a reakciót kis koncentrációjú meghosszabbított kétszálű cDNS és linearizált pBR 322 jelenlétében kell végeznünk. Például úgy járunk cl, hogy a dczoxi-nuklcolidokkal meghosszabbított (például dCMP-vel meghosszabbított) kétszálű cDNS-t és a linearizált de, zoxi-nukleotid-meghosszabbított (például dGMP- vel meghosszabbított) pBR 322-t tartalmazó keveréket négyszer 1 órán át különböző hőmérsékleten (például 65 °C-on, 46 ‘C-on, 37 ”C-on és 20 “C- on) inkubáljuk. Az összeforrasztott dezoxi-ribonukleinsavat közvetlenül használhatjuk fel megfelelő baktérium, például E. coli HB 101 transzformálására. Itt meg kell jegyeznünk, hogy a fenti összeforrasztási reakció során kapott termék rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat tartalmaz, ezek közül azonban csak igen kevés HuLylFN-t meghatározó, mivel a legtöbb rekombináns olyan cDNS szakaszt tartalmaz, amely nem LyIFN mRNS-ből származik. ej Az E. coli HB 101 transzformálása az összekapcsolt hibrid plazmidokkal Az összeforrasztott, az előzőek szerint előállított hibrid plazmidokkal E. coli HB 101 sejteket transzformálunk. A plazmidok a sejten belül replikálódnak, és a replikációs piazmidmásolatok a sejt osztódásakor elosztanak a leánysejtek között. Az összeforrasztott hibrid plazmidokkal az E. coli HB 101 sejteket úgy transzformáljuk, ahogy azt az irodalomban olvashatjuk. Az eljárás során a sejteket kalciumionokkal előkezeljük, ekkor a dezoxi-ribonukleinsav beléphet a sejtbe (például 35), ha a hibrid plazmiddal inkubálunk. Ezután a sejteket szelektív növesztő táptalajra juttatjuk, amikor elválaszthatjuk a szülősejteket a transzformáltaktól. Mivel a hibrid plazmid tartalmazza a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént, tetraciklint tartalmazó agaron előnyösen szelektálhatunk. . Például úgy járunk el, hogy a kaiciumionokkal előkezelt E. coli HB 101 sejteket és a hibrid plazmidot kalciumsót, például kalcium-kloridot és magnéziumsót, például magnézium-kloridot tartalmazó pufferban inkubáljuk. Megfelelő, például 10- 40 |x.'rccs inkubációs időt követően 35—42 ’C hőmérsékleten hővel kezeljük a baktériumokat, ez a kezelés általában rövid ideig, 1-5 percig tart. Ezután lehűtjük a sejteket, és agarra, például triptent tartalmazó agarra, vagy McConkey-agarra szélesztjük, az agárhoz természetesen megfelelő mennyiségű tetraciklint adunk. A tetraciklint tartalmazó táptalajon növekvő sejtek tartalmazzák a recirkularizált plazmidot, vagy a hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. A növekvő telepeket izoláljuk, és megfelelő kiónok elkülönítésére vizsgáljuk. 4) A lymphoblastoid 1FN cDNS-t tartalmazó klánok azonosítása f a) Az LyIFN cDNS-t tartalmazó kiónok azonosítására használható módszerek Specifikus géneket tartalmazó telepeket különböző módszerekkel azonosíthatunk, például a ribonukleinsav szelektálására használt hibridizációval, megkülönböztető hibridizációval, egy egyrészről szintetikus próbával való hibridizációval, vagy másrészről egy adott gén által meghatározott terméket tartalmazó telepeket immunológiai vagy biológiai méréssel azonosítjuk. Az immunológiai és biológiai módszerek azon alapszanak, hogy a génterméket immunológiai vagy biológiai módszerekkel azonosítjuk, az elsőf; 10 15 23 25 30 25 40 ■15 50 55 60 65 10
