197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
ie 197 047 20 rendit módszerek azonban alapvetően azon alapszanak, hogy rendelkezésünkre áll-e megfelelően tisztított, így nem specifikus hibridképződésre alkalmatlan próbák. Megfelelő próbák azok az mRNS-molekulák, amelyek komplementerek az adott génre vagy a megfelelő cDNS-re. Humán leukocita vagy fibroblast interferont tartalmazó baktérium-klónok kiválasztására különböző módszerek ismeretesek. így például Goeddel és munkatársai (13) és Sugano és munkatársai (16) az interferon géneket két hibridizációs kísérlet vizuális összehasonlításával azonosítják. A kísérletek egyik részében az indukált sejtekből izolált mRNS keverék reverz transzkriptázzal való kezelését követően szintetizált radioaktív cDNS-molekulákat hibridizálják. A jelzést P32-jelzett CTP- vel végzik, az előállítás során oligo-(dT) (Sugano) vagy szintetikus dezoxi-undeka-nukleotidot (Goeddel) használnak primerként. A kísérletek másik részében nem indukált sejtekből nyert mRNS keverékből a fentiekhez hasonló módon előállított radioaktív cDNS-sel hibridizálnak. Az eljárásra a specificitás és a reprodukálhatóság hiánya jellemző, ahogy az a közölt adatokból kiderül. Weissmann (3) olyan módszert ír le, amelynek során a ribonukleinsav szelekciós hibridizációját több lépésben végzik el. A fenti módszerek nem alkalmasak a találmány szerinti eljárásra az LyIFN-a és ß-g6nek izolálására, mivel az interferon-ß mennyisége csupán 10%-a az interferon-a mennyiségének a humán LyIFN-ben. Ez a mennyiség nem haladja meg a fenti módszerek detektálható határát. Mivel a találmány szerinti eljárás megszületése előtti módszerek nem alkalmasak, új módszert dolgoztunk ki. Ez abból áll, hogy mind az IFN-a, mind az IFN-ß mRNS-molekulákra komplementer 5’-terminálisan jelzett oligo-dezoxi-nukleotidot szintetizálunk, az oligo-dezoxi-nukleotidot primerként felhasználva az LyIFN mRNS szempontjából koncentrált poli-(A)-ribonukleinsavat reverz transzkriptázzal kezeljük, és szűrőhöz kötött plazmid dezoxi-ribonukleinsavakkal hibridizáljuk a jelzett cDNS próbát. A módszer lehetővé teszi azoknak az IFN-a és ß-göneknek a specifikus, gyors és közvetlen detektálását, amelyek tartalmazzák a szintetizált primer oligo-dezoxi-nukleotid bázisszekvenciát, ugyanakkor nem szükséges az irodalomban előzőleg leírt módszerekben szereplő hibridizációs-transzlációs mérések elvégzése. Az in situ telephibridizáció Grunstein és Hogness (36) és mások általános módszerén alapszik. A módszer szerint növesztjük a telepeket, és nitrocellulóz szűrőre juttatjuk, alkalikus kezeléssel lizáljuk, és in situ rögzítjük a szűrőre. Az adott génre komplementer radioaktívan jelzett nukleinsavat hibridizáljuk a szűrőhöz kötött dezoxi-ribonukleinsawal. A hibridizált próbát auto-radiográfiásan vizsgálhatjuk, a hibridizálódó dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó megfelelő telepeket a kontroll nitrocellulóz szűrőkről izolálhatjuk. A klónozott humán IFN-oc és IFN-ß cDNS-ek kódoló szálainak összehasonlításakor kiderült, hogy egy 13 nukleotidból álló rész jelen van a cDNS-moleku .íkban (és érthetően, a megfelelő mRNS-molekii' íkban is) (23). így a fentiekben ismertetett bázisszekvenciájú szintetikus, 13 r ikleotidból álló oligo-dezoxi-nuk- Seotid használna k a humán iymphoblastoid JFN-a és IFN-ß mRNS-ből kiinduló cDNS szintézis prime reként. b) A P32-jelzete humán IFN-a. és lFN-$ specifikus cDNS próba előállítása Több ismert módszer létezik adott szerkezetű oligo-dezoxi-nukleotid szintézisére (37). Az oligodezoxi-nukleotid szintézist például kémiai módszerekkel végezhetjük, például a diészter vagy triészter módszerrel. A diészter módszer alaplépése a két megfelelően védett dezoxi-nukleotid összekapcsolása, amiután foszfo-diészter kémiai kötést tartalmazó didezoxi-nukleotidot kapunk. A triészter módszer különbözik a diészter módszertől, mégpedig abban, hogy a foszfátcsoporlokon egy további szerves védőcsoport van jelen, abból a célból, hogy a dezoxi-nukleotidok és az oligo-dezoxi-nukieotidok szerves oldószerekben oldhatóak legyenek. A szintézist polinukleotid-foszforilázzal enzimatikusan végezhetjük, szabályozott reakciókörülmények között. Ily módon egy rövid oligo-dezoxi-nukleotidhoz elsősorban egy dezoxi-nukleotid kapcsolódik. A reakciót oldatban vagy szilárd fázishoz kötötten végezhetjük, az utóbbit jelenleg előnyösebbnek tartják. Az 5’-CCITCTGGAACrG-3’ képletű, 13 tagból álló oligo-dezoxi-nukleotid szintézisét (ez komplementer a humán IFN-a- és IFN-ß-mRNS- rc) úgy végezzük, hogy Itakura (38) és Rooij (39) módszere szerint triészteres eljárást alkalmazunk védett mono-, di- és tridezoxi-nukleotidokat használva kiindulási anyagként. Az eljárás egyetlen lépését egy dinukleotid szintézise kapcsán az (1) reakcióegyenleten mutatjuk be. A reakcióelegyben szereplő képletekben Rj, R2 és R3 védőcsoportokat jelent, a IN és dN’ purin- vagy pirimidin-bázisok, a kend. kondenzálószert jelent. A fenti szintézishez használt kiindulási anyagokat (védett vagy részlegesen védett mono-, di- vagy iridezoxi-nukleotidokat) az irodalomból ismerjük. A védőcsoportokat úgy választjuk ki, hogy ezeket enyhe reakciókörülmények között, a nukleotidok 3’-5’-kötéseinek hasadása nélkül a reakciót követően eltávolfthassuk. Előnyös R3 védőcsoportok például a monometoxi-tritil- vagy' dimetoxi-triúl-csoport, előnyös R2 védőcsoport például a 2-klór-fenil-csoport, és előnyös R3 védőcsoport például a 2-ciano-etil-csopoit. Az adeninen, guaninon és citozinon levő exociklikus aminocsoportokat elsősorban acilcsoportokkal, például benzoilvagy izob’utirilcsoporttal védjük. Kondenzálószerként 2,4,6 - triizo - propi! - benzol - szuifonsavat használunk. Az egyedi védőcsoportok (például R3, R, és R2) specifikus eltávolítását a köztes vegyületekből, és a rgeljesen védett, 13-tagú, oligo-dezoxi-nukleotid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
