197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
15 197 047 16 ző hasított molekulát kapunk. (Ezek az ügy nevezett „ragadós” végek.) A dezoxi-ribonukleinsav szegmenseket általában egyszálű kohéziv végeikkel kapcsoljuk egymáshoz, és dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, például T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kovalensen kapcsoljuk. Komplementer végeket két különböző úton állíthatunk elő: vagy restrikciós enzimeket használva ragadós hasítást végzünk, és kohéziv végeket állítunk elő, vagy adott egyszálű szekvenciákat (például homopolimer végeket) kapcsolunk a molekulához. T4-ligázzal ezenkívül összekapcsolhatunk teljes mértékben bázispárokat tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-duplexeket, és tompa végeket is. így például a pBR 322 plazmidot megfelelő restrikciós endonukleázzal, például Pst I enzimmel hasítunk, a linearizált plazmidot és a kétszálű cDNS molekulát, amit be akarunk építeni, megfelelő enzim, például terminális dezoxi-nukleotidil-transzferáz segítségével egyszálű homopolímer végekkel meghosszabbítunk. Például az egyik dezoxi-ribonukleinsav termékhez poli-(dC)-véget, míg a másikhoz poli(dG)-végeket kapcsolunk (természetesen dA és dT végeket is használhatunk). A két típusú dezoxi-ríbonukleinsavat ezután komplementer végeiknél összekapcsoljuk. Gazdasejtként például élesztőket, és előnyösen baktériumokat használhatunk, amelyek transzformációra érzékenyek, és restrikciós enzimeket, továbbá modifikációs enzimeket nem tartalmaznak. Ilyen mikroorganizmusok például az E. coli törzsek, mint például az E. coli X 1776, vagy az E. coli HB 101; használhatunk például Bacillus subtilis, Bacillus stearothcrmophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus és más baktériumokat, vagy ezek mutánsait. Az előzőekben megadottak szerint előállított rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulát ismert transzformációs eljárással, például a gazdasejtek kalcium ionokkal való előkezelését követően transzformálhatjuk. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav plazmidot, amely megfelelő fenotípusos tulajdonságokkal, például tetraciklin rezisztenciával rendelkezik, a sejtekbe juttatva, például tetraciklint tartalmazó agaros táptalajon szelektálhatjuk. Az eljárás során előnyös vektor dezoxi-ribonukleinsavként a pBR 322 plazmidot használjuk, miután megfelelő restrikciós endonukleázzal, előnyösen Pst I enzimmel hasítottuk. Ezt kapcsoljuk komplementer homopolímer végek segítségével a kétszálű cDNS-hez, a végeket dG:dC-végekkel látjuk el. A kapott rekombináns dezoxi-ribonukieinsavat E. coli HB 101 sejtekbe transzformáljuk. Az előzőekben megadott szintézissel előállított és interferon géneket tartalmazó kétszálű cDNS helyett a megfelelő kromoszómális dezoxi-ribonuk- Ieinsavat is használhatjuk, interferon aktivitással rendelkező polipeptideket termelő kiónok előállítására. A kromoszómális dezoxi-ríbonukleinsavat humán lymphoblastoid sejtekből kapjuk, például Namalwa sejtekből, ismert módszerekkel, például a teljes kromoszómális dezoxi-ribonukleinsav Alu I enzimmel való részleges hasításával. A kapott fragmenseket EcoR I linkereket használva lambda Cl áron 4A szálakhoz kötjük, de eljárhatunk tígy is, hogy a kromoszómális dezoxi-ribonukleinsavat restrikciós enzimmel hasítjuk, például Kpn I vagy Hind 111 endonukleázzal. és az így kapott fragmenseket vektor dezoxi-ribonukieinsavhoz, például pBR 322 plazmidhoz vagy kozmid dezoxi-ribonukleinsavhoz ligáljuk. A rekombináns vektor dezoxiribonukleinsawal gazdasejtet, például E. coli-t transzformálunk. A kormoszómális interferon órás P-géneket tartalmazó telepeket telephibridizációval (lásd 4a/ pont), vagy radioaktívan jelzett, szintetikus oligonukieotid vagy radioaktívan jelzett a- és ß-spccifikus interferon cDNS próbával azonosítjuk. Az azonosított rragmensek hasításával szubfragmensekhez jutunk. A hasítást egy megfelelő endonukleázzal vagy megfelelő exonukleázzal végezzük. A fentiek szerint humán lymphoblastoid sejtekből származó, egy interferonszerű polipeptidct meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát vagy ennek egy variánsát vagy mutánsát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsavat, vagy olyan dezoxi-ribor ukleinsavat állítunk elő, amely a fenti dezoxi-ribonukleinsawal hibridizálódik. Úgy járunk el, 'iogy 1) a HuLylFN-mRNS-ből egyszálű komplementer dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő, adott esetben ebből készítünk egy kétszálű cDNS-molekulát, -agy 2) a humán lymphoblastoid sejtek kromoszómális dezoxi-ribonukleinsavát részlegesen hasítjuk, és kiválasztjuk azokat a fragmenseket, amelyek kromoszómális LylFN géneket tartalmaznak, és abban az esetben, ha a fenti szekvenciájü íragtnensre van szükségünk, a dezoxi-ribonukleinsavat megfelelő restrikciós endonukleázzal kezeljük, vagy a dezoxiribonukleinsavat megfelelő exonukleázzal részlegesen emésztjük, vagy abban az esetben, ha rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat akarunk előállítani, ügy a dezoxi-riboinikleinsavat megfelelő vektor dc~ zoxi-ribonukleinsavba építjük be. b) A linearizált, dezoxi-nukleotiddal meghosszabbított pUR 322 előállítása Az eljárás során használt előnyös vektor, a pBR 322 plazmid 4361 bázispárbó! álló kis plazmid. Két, ampicillin és tetraciklin rezisztenciát meghatározó gént (ampb tetr) tartalmaz, így a recipiens baktériumsejtek közül szelektálható és azonosítható a transzformált sejt. A pBR 322-molekulán belül több restrikciós hely van. Az ampicillin rezisztenciát meghatározó génen belül Pst I helyet találunk, míg a tetraciklin rezisztencia génen belül BamH 1, Hind III és Sal 1 helyet találunk. Másutt egyetlen EcoR I hely van (34). Az előzőekben említett restrikciós encíonukleázok közül egyet használva vagy az ampicillin, vagy a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén, vagy mindkét gén változatlan marad. így az említett enzimek bármelyike felhasználható a pBR 322 hasítására és linearizálására. Miután a pBR 322 plazmidot linearizáltuk, terminális dezoxi - nukleotidil - transzferázzal dezoxi-5 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60 65 9
