197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
13 197 047 14 hosszúságii kontroll dezoxi-ribonukleinsav jelenlétében (lásd például 32). b) A kétszálú cDNS előállítása A fentiek szerint előállított egyszálű cDNS a 3’végen úgynevezett hajtúszerkezcttel rendelkezik. Ez a haj tűszerkezet azt jelenti, hogy egy rövid kétszálú szakasz van jelen, ez pedig a második dezoxiribonukleinsav-szál következő szintézisekor önmaga szintézisét indítja el. így további primer nem szükséges. A kétszálú cDNS-t ribonuklcinsav-dependens dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal, például a madarak myelomavfrusának (AMV) reverz transzkriptázával szintetizáljuk, az egyszálú cDNS szintézise kapcsán a fentiekben megadottak szerint eljárva, azzal a különbséggel, hogy a poli-(A)-ribonukleinsav helyett egyszálú cDNS-t használunk, és nem adagolunk prímért. 1 lasználhatunk más dczoxi-ribonukleotid prekurzcrokból dezoxi-ribonukleinsavat polimerizáló enzimet is, például a T4 dezoxiribonukleinsav-polimerázt, az E. coli dezoxi-ribonukleinsav polimerázt (Klenow-fragmens), vagy előnyösen az E. coli dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz 1 enzimet. A második lánc szintézisét úgy végezzük el, hogy egyszálú cDNS-t tartalmazó pufferelegyben reagáltatunk; az elegy magnéziumsót, például magnézium-kloridot, egy merkaptánt, például ditio-treitolt, a 4-dezoxi-nukleozid-trifoszfátot (ezek közül az egyik, például H3-mal radioaktívan jelzett), és egy dezoxi-ribonukleinsav-polimerázt, például E. coli dezoxi-ribonukleinsav-polimeráz I enzimet tartalmaz. A reakció leállítása után fehérjementesítjük az elegyet (lásd 2a/ pont), és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. A kapott kétszálú dezoxi-ribonukleinsav a két dezoxi-ribonukleinsav-szálat összekötő, úgynevezett haj tűszerkezetet tartalmaz. Ezt a hurkot Slnukleázzal hasítjuk, amikor bázispárokból álló végekkel rendelkező kétszálú cDNS-t kapunk. Az emésztést egy pufferelegyben végezzük, a terméket a második szál szintézisét követően cinksó, például cink-szulfát jelenlétében Sl-nukleázzal kezeljük. Az emésztést SDS és EDTA adagolásával állítjuk le. Az elegyet fenollal fehérjementesítjük, az oldatot Sephadex oszlopon kromatografáljuk. A kétszálú cDNS molekulákat tartalmazó frakciókat (ezeket például az egyes frakciók Cerenkov-sugárzásának mérésével határozhatjuk meg) összegyűjtjük, és a kétszálú cDNS-t etanollal kicsapjuk. A szintetizált kétszálú cDNS még mindig tartalmaz nagyszámú, különböző dezoxi-ribonukleinsavmolekulát, és ezért előnyösen növeljük az oldat teljes kétszálú cDNS-tartalmát. Erre a célra például gélszűrést, poli-akrilamid vagy agarózgélen való elektroforézist, illetve szacharóz-gradiens jelenlétében centrifugálást végzünk. Ha a terméket ismert molekulasúlyú dezoxi-ribonukleinsav molekulákkal együtt elektroforetizáljuk, centrifugáljuk, vagy együtt végezzük az elektroforézist, úgy lehetővé válik az interferon kétszálú cDNS-molekulák várható nagysága szerint a számunkra szükséges kétszálú cDNS-molekulák lokalizálása (az interferon kátszálú cDNS 700—1200 bázispárt tartalmaz, az alábbi irodalmi hivatkozások szerint: 14., 16., 18., 33.). Úgy járunk el, hogy a kétszálú cDNS- t például pufferban oldjuk, és szacharóz gradiensen (például 5—23%) centrifugáljuk. A marker dezoxi-ribonukleinsawal együtt párhuzamos gradiensen centrifugált dezoxi-ribonukleinsav molekuláknál gyorsabban ülepedő terméket (például 700-800 bázispárból álló kontroll) izoláljuk. 3) A IluLylFN kétszálú cDNS-t nagy mennyiségben tartalmazó kétszálú cDNS termék klónozása a) Általános megjegyzések A fentiek szerint (2/b pont) előállított cDNS klónozását ismert módszerekkel végezzük. Az eljárás során a kétszálú cDNS-t megfelelő vektor dezoxi-ribonukleinsav molekulához kötjük, és a kapott rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat megfelelő gazdasejtbe juttatjuk (ez a transzformáció), ahol az replikáiódni képes. A vektor dezoxi-ribonukleinsav olyan dezoxi-ribonukleinsav-molekula, amely saját replikációját biztosító genetikai funkciókat tartalmaz, a replikáció gazdasejtbe transzformálva lehetséges. Előnyös továbbá, ha a vektor olyan gént tartalmaz, amelynek segítségével a plazmidot tartalmazó gazdasejtek (transzformánsok) kiválaszthatók nagyszámú sejt közül, amelyek a plazmidot nem tartalmazzák. A génsebészetben általánosan használt vektor dezoxi-ribonukleinsavak a kör alakú plazmid dezoxiribonukleinsavak és bizonyos fágok DNS-e, ezekhez a kétszálú cDNS kísérleti úton hozzáköthető, például ilyen a lambda-bakteriofág, és előnyösen a col-El plazmid, vagy ennek származékai, például a pMB 9, pSF 2124, pBR 317 és előnyösen a pBR 322 plazmid. Az említett plazmidok ampiciilinnel szembeni rezisztenciát meghatározó géneket tartalmaznak, részben pedig tetraciklin rezisztenciát biztosító gént is. így, egy ilyen plazmidot tartalmazó gazdasejt olyan fenotípussal rendelkezik, amely lehetővé teszi a gazdasejtek közül a transzformánsok elkülönítését. Rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekula előállítására például egy megfelelő plazmidot, mint például a pBR 322 plazmidot hasítjuk, a kétszálú dezoxi-ribonukleinsavat beépítjük a linearizált molekulába, és újra összezárjuk a gyűrűt, amikor a beépített kétszálú cDNS szegmens! tartalmazó, megnagyobbodott rekombináns plazmid molekulát kapunk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat egy adott helyen hasítjuk. Erre a célra nagyszámú restrikciós endonukleáz áll rendelkezésünkre, amelyek specifikus dezoxi-ribonukleínsav-szekvenciákat ismernek fel. Egyes restrikciós endonukleázok mindkét dezoxi-ribonükleinsav szálat azonos ponton hasítanak, ilyenkor úgynevezett tompa végek keletkeznek. Mások néhány nukleotiddal egymással elválasztott kötéseket hasítanak, ilyenkor szabad egyszálú végekkel rendelke5 10 15 2C 25 30 35 rQ 45 50 55 60 65 8
