197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
11 197 047 12 termelt IFN citopatikus bioméréssel, például Armstrong kötőmódszere szerint (29), vagy Stewart és munkatársai szerinti (31) citopatikus hat ás csökkenéssel, megfelelő fertőző vírust, például vcsicularis stomatitis vírust (VSV) és emberi sejtvonalat, például CC1-23 vagy Hep-2 sejteket használva határozható meg. Ha úgy akarjuk, a leírásban megadott eljárás bármely stádiumában a megfelelő dezoxi-ribonukleinsavból, például a kétszálú cDNS-ből származó bármilyen tisztaságú izolált ribonukleinsav HuIF mRNS-aktivitása a fenti eljárások egyikével meghatározható. d) Az LyIFn specifikus mRNS-tartalom növelése Az egyéb szennyező ribonukleinsavak, például a transzfer- vagy riboszómális-ribonukleinsav, továbbá a dezoxi-ribonukleiusav eltávolítását követően a 0,5 mmól—1,0 mmól EDTA oldatban levő poli(A)-ribonukleinsav fenolos extrakciókkal vagy Chelex-oszlopon való tisztítással (a kétértékű kationok eltávolítása) tovább tisztítható. A készítmény lymphoblastoid HulFN mRNS-t reprezentáló poli-(A)-ribonukleinsav frakciójának növelésére az irodalomból ismert, különböző módszereket használhatunk. A módszerek alapvetően az egyes mRNS-fajták különböző molekulatömegén alapszanak. A poli-(A)-ribonukleinsav nagyság szerinti frakcionálását például dextrán-származékokbó! vagy poli-akrilamidból készült oszlopokon végzett gélszűréssel éljük el. A gélszűrés során a kisebb ribonukleinsav-molekulák különböző mértékben haladnak át a gélrészecskéken, a nagyobb molekulák viszont nem lassulnak le, hanem áthaladnak az oszlopon. A poli-(A)-ribonukleinsav keverék egyes molekulái zóna-elektroforézissel is frakcionálhatók, ezt pöli-akrilainiddal, keményítővel vagy agarózgéllel végezzük. A poli-(A)-ribonukleinsavak elkülöníthetők zóna centrifugálással is, szedimentációs sebességük alapján, a centrifugálást szacharóz sűrűségi grádicnssel végezzük 5—23%-os szacharóz grádienst használva. A poli-(A)-ribonukleinsav-keverékek frakcionálását például az alábbiak szerint végezzük: Az egyéb ribonukleinsav és dezoxi-ribonukleinsav fajtáktól mentes poli-(A)-ribonukleinsav-oldatot a molekulák nagysága szerint frakcionáljuk 5-23 %-os szacharóz sűrűségű grádienst felhasználva, olyan pufferrendszerben, amely kevés etiléndiamino-tetraecetsavat tartalmaz. A frakciókat összegyűjtjük és a fentiek szerint [(le) pontban megadottak] meghatározzuk interferon mRNS-aktivitásukat. A legnagyobb interferon mRNS-aktivitással rendelkező frakciókat összegyűjtjük, és oligo(dT)-ccllulóz vagy poli-(U)-szcfaróz (sepharose) oszlopra öntjük. A HuLylFN mRNS-ben gazdag kötött poli-(A)-ribonukleinsavat vízzel eluáljuk és etanollal kicsapjuk. Ezután ismét meghatározzuk a fentiekben megadottak alapján (le) a HuLylFN mRNS-aktivitást. A szacharózzal végzett gradienscentrifugáláskor általában 10—20-szoros HuLylFN mRNS koncentrációnövekedést érünk el. 2) A lymphoblastoid kétszikű, HuLylFN kétszálú cDNS-t tartalmazó cDNS előállítása A HuLylFN mRNS-ben g.izdag poli-(A)-ribonuklcinsavat (amit az ld/ pont szerint állítottunk elő) templátként használjuk fel, kétszálú cDNS előállítására. A konverzió során egyszálú cDNS-t állítunk elő, szintetizáljuk a második dezoxi-ribonukleinsav-szálat, és az elsődlegesen keletkezett terminális, úgynevezett „hajtű”-szerkezetet leemésztjük. a) Az egyszálú cDNS előállítása A fentiekben (ld/ pont) megadott poli-(A)rlbonukleinsavra komplementer egyszálú dezoxi-ribonukleinsavat az adott ribonukleinsav reverz transzkripciójával állítjuk elő. A szintézist ribonukleinsav-dependcns dezoxi-ribonukleiusav polimerázzal (reverz transzkriptáz) katalizáljuk, ezt például a madarak myeloblastosis vírusából izoláljuk. A vírus reverz transzkriptáza nem iniciálja az egyszálú ribonukleinsavon a dezoxi-ribonukleinsav-szintézist. Abban hasonlít a dezoxi-ribonukleinsav polinterázhoz, hogy szabad 3’-hidroxilcsoport?al rendelkező prímért igényel, ami bázispárral kapcsolódik a ribonukleinsav templát szálhoz. Az mRNS 3'-végéhez kapcsolt poli-(A)-végek miatt előnyös, ha printerként oligo-dezoxi-timidilátot (oligo-dT) vagy poli-(U)-t használunk. Ha ismert a szekvencia, úgy a cDNS szintézist az adott génre szelektíve elvégezhetjük. Az egyszálú cDNS szintézisét az alábbiak szerint végezzük. A fentiek szerint eljárva izoláljuk és tisztítjuk a poli-(A)-ribonukleinsavat, majd egy pufferelegyben egy printerrel, például oligo-(dT)-vel reagáltatjuk magnéziumsó, például magnéziunt-klorid, merkaptán, például ditio-treitol (DTT), dATP, dGTP, dCTP, dTTP és AMV (vírus) reverz transzkriptáz jelenlétében. A dezoxi-nukieozid-trifoszfátokból előnyösen sokat adunk a reakcióelegyhez, hogy a teljes másolat szintézise könnyen megtörténjen. Az egyszálú cDNS ezt követő tisztítását megkönnyíti, ha a 4 dezoxi-nukleozid-trifoszfát egyikét jelöljük, például PJJ-vcl. A reakciót gátló elegy, például EDTA-t és SDS-t tartalmazó oldat adagolásával állítjuk le. A reakció leállítását követően a terméket fehérjementesítjük, például oly módon, hogy az oldatot fenollal és kloroformmal extraháljuk, és ezután Sephadex oszlopon kromatografáljuk, a sók és a be nem épült dezoxi-nukleozid-trifoszfátok eltávolítására. A szintetizált cDNS-t tartalmazó frakciókat (feltételezve, hogy a dezoxi-nukleozid-trifoszfátok egyikét P32-vel jelöltük, és így a felhasználható frakciókat a Cerenkov-sugárzás mérésével könnyen azonosíthatjuk) összegyűjtjük, és a ribonukleinsavat, valamint a cDNS-t izoláljuk, például elnnotos kicsnpással. A templát ribonukleinsavat ribonuklcázzal eltávolítjuk, például RNázA vágy RnázTl használatával, vagy előnyösen lúgos hidrolízissel, például nátrium-hidroxiddal. A visszamaradt cDNS nagyságát például elektroíoretikus mozgékonysága alapján állapítjuk meg, az elektroforézist alkalikus agarózgélcn vagy poli-akrilamid-gélen végezzük, ismert 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
