197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
9 197 047 10 Az indukálás előtt a lymphoblastoid sejteket rövidszénláncú alkánsavakkal, például vajsawal vagy ezek sójával kezelhetjük, ugyanis ismert, hogy ilyenkor a lymphoblastoid sejtek interferon termelése fokozódik (27, 28). Ezenfelül, ha szükséges és kívánatos, a lymphoblastoid sejteket kis mennyiségű homológ interferonnal Is kezelhetjük. A lymphoblastoid sejtek indukálását az irodalomból ismert módszerekkel végezzük. A lymphoblastoid sejteket, például a Namalwa sejteket ismert táptalajban (például RPMI 1640 táptalajban) tenyésztjük, a táptalajt 10% boíjűszérummal egészítjük ki. A tenyésztést például 10*—107 sejt/ml sejtsűrűségig végezzük. A táptalajból centrifugálással kinyert sejteket táptalajban újra szuszpendáljuk, és a megfelelő vírus, például a Newcastle-betegség vírusának adagolásával indukáljuk. Az adagolt vírusmerinyiség 200 hcmagglutinációs egység/ 10,i sejt. Az indukciói megfelelő ideig, például 5-16 órán át végezzük. Ahogy az indukált sejtek interferont termelnek, mégpedig megfelelő titerben, összegyűjtjük a sejteket, és az alábbiak szerint tovább kezeljük. Az interferon-aktivitást például a festékfelvételen alapuló Armstrong-módszerrel (29) határozzuk meg. b) Az indukált sejtek feltárása A nukleinsav izolálásának első lépése annak leválasztása a többi sejtkomponenstől, ezt úgy végezzük, hogy a sejtet feltárjuk és eltávolítjuk a szenynyező proteineket. A sejtek feltárását végezhetjük ismételt fagyasztással és felolvasztással, mechanikai hatásokkal, például üveghomogenízáldban homogenizálva, végezhetjük ozmotikus sokk-kai, ultrahangos besugárzással és lítikus hatású kémiai szerekkel, például anionos detergensekkel, mint például nátrium-dedecil-szulfáttal, lítium-dodecilszulfáttal, nátríum-4-amino-szaüciláttal, nátriumdodecil-szarkozináttal vagy nátrium-tri-izopropilnaftalin-szulfonáttal. Bizonyos esetekben az anionos detergensek használatakor a nukleinsavak részlegesen leválnak a protein-komplexekről, és részlegesen gátolódik a ribonuklcáz-aktivilás. Az eljárást előnyösen nagy koncentrációjú detergenssel végezzük, ás a reakcióidőt a lehető legrövidebben választjuk meg, amikor a nukleinsavak teljes mértékben leválnak, különösen a ribonukleinsav, és ugyanakkor a legkisebb mértékben hasadnak-. Előnyösen úgy járunk el, hogy az indukált sejteket megfelelő anionos detergenssel, például nálrium-dodecil-szulfáttal lizáljuk, ismert pufferban, például TNE-ben. Rövid reakcióidőt követően deproteinizálószerrel kezeljük a szuszpenziót, ezt a következő, c) pontban ismertetjük. c) A lymphoblastoidpoli-(A)-RNS elkülönítése a szennyező fehérjéktől, Upoproteinektől, és a különböződezoxi-ribonukleinsavaktól és ribonukleinsavaktól A kapott nukleinsav-keverék deproteínízálását kémiai szerekkel, például i-4% 1-pentanolt tartalmazó ki;reformmal, vagy előnyösen fenollal végezzük. últávolíthatjuk a proteineket proteázos, például p.onázzal vagy proteáz P-vel, kivitelezett emésztéssel, az emésztés során a proteinek aminosavakká hidrolizálódnak. A proteinek teljes eltávolítására két kémiai kezelést, például fenolos és k!oroforxnos kezelést, vagy proteázos emésztést, és ezt követően — például —- fenolos kémiai deproteinizálást végzünk. Az eljárás során a nukleinsav-keverék proteinmentesítését proteázzal, például pronázzal való kezeléssel és az ezt követő fenolos és ezután kloroformos cxtrakcíóval végezzük. A fenolos rendszerrel majdnem az összes denaturált és emésztett protein a fenolos és az interfázisba kerül. A poli-(A)~RNS előző és következő kinyerési lépései során az mRNS bomlását kevés radioaktív jelzett mRNS, például 1I2J-jelzett globtn mRNS adagolásával szabályozzuk. A szennyező dezoxi-ribonukleinsav emésztésére tisztított (ribonukleáz-mentes) dezoxi-ribonukleázt használunk. Elkülöníthetjük a dezoxi-ribonukieínsav-meníes ribonukleinsavat egyensúlyi cézium-klorid gradiens cenfrifugálássa! is. Elkülöníthető a ribonukleinsav a dezoxi-ribonukleinsavtól kromatográfiás módszerekkel, például hidroxi-apatit oszlopon végzett kromatográfiával is. A tisztított oldatban jelenlevő mRNS molekulák különböznek az egyéb ribonukleinsavaktól, például a transzfer- vagy a riboszómális ribonukleinsavtól abban, hogy' 3’-végükön adenozin-nukleotidokból álló 100—200 nukleotid hosszúságú, megszakítatlan szekvencia található. Ezt a poli-(A)-láncot használhatjuk feí ismert módon az mRNS elkülönítésére. Az elkülönítést például oligo-(dT)-ccllulóz vagy poli-(U)-szefaróz (sepharose) oszlopon is többszöri adszorpcióval. Az oszlophoz kötött poli(A)-ribonukleinsavat gyenge ionerősségű oldattal, például vízzel eluálva. A poli-(A)-ribonuk!einsav izolálását előnyösen úgy végezzük, hogy a nukleinsav keveréket, amelyet az indukált sejtek lízise után kapunk (lb. lépés), proteázzal kezeljük, az elegyet fenollal és ezután kloroformmal cxtraháljuk n denaturált és emésztett proteinek eltávolítására, majd az így kapott oldatot oligo-(dT)-celluldz oszlopon kromatografáljuk, és a kötött poli-(A)-ribouuldeinsavat vízzel eluáljuk. Ha úgy kívánjuk, vagy ha úgy szükséges, az oligo-(dT)-cellulóz oszlophoz való adszorpciót többször megismételjük. A kísérletnek ebben a fázisában meghatározhatjuk a po!i-(A)-ribonukleinsav képességét a HuIFN- aktivitást mutató polipeptid-szintézisre in vitro transzlációs rendszerben (például retikulocita transzlációs rendszerben, Xenopus laevis). Az interferon specifikus polipeptidcket radioimmun méréssel, vagy előnyösen citopntikus bioméréssel azonosítjuk. Úgy járunk el, hogy az izolált poli-(A)ribonukleinsav egy mintáját megfelelő oldószerben, például vízben oldjuk, 1 mmólos töménységű EDTA-oklattal hígítjuk, de végezhetjük a hígítást valamilyen pufferra! is. Az oldatot mikroinjekcíóval a Xenopus laevis oocitájába juttatjuk Colman és munkatársai szerint eljárva (30). Az oocitákban 5 13 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
