197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
39 197 047 40 gé!re juttatjuk (Peacock és munkatársai, 32). Az autoradiogrammon egyetlen csík figyelhető meg, ez a pBR 322 plazmid Hae Ili enzimmel kapott 267 bázispárból és 435 bázLspárhól álló P32-jelzett marker dezoxi-ribonukleinsav fragmensek között mozog. A P33-jelzett cDNS fragmenst exíraháljuk a gélből, és Mueller és munkatársai szerint eljárva (47) tisztítjuk. A termékként 20 000 beütés/perc Cerenkov-aktivitású P32-jelzett humán IFN-a és IFN-ß specifikus cDNS-próbát kapunk. c) A HulFN cDNS-t tartalmazó telepek kiválasztdsa (3. ábra) A 4. példában megadottak szerint előállított 1650 transzformáns telepet BA 85 (Schleicher and Schuell, 8 cm átmérőjű) nitro-cellulóz szűrőre viszszük. A sejteket lizáljuk, és dezoxi-ribonukleinsav tartalmukat denaturáljuk, majd in situ a szűrőkre fixáljuk Grunstein és Hogness szerint eljárva (36). A telepeket tartalmazó szűrőket 4xSET-oldattal előhibridizáljuk (az oldat 0,15 M náirium-kloridot, 30 inM trisz - hidrogén - kloridot, pH = 8,0, 1 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmaz). Az előhibridizációt az alábbi vegyületek jelenlétében végezzük: 0,1% Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% pclivinil-pirrolidon (PVP-360, Sigma), 0,1% marhaszérum albumin, 0,5% nátrium - dodecil - szulfát, 50 pg/ml denaturált boijtí thymus dezoxi-ribonukleinsav (ezt az alábbiak szerint állítjuk elő: 5 mg borjú thymus dezoxi-ribonukleinsavat (I típus, Sigma), 10 percen át a dezoxi-ribonukleinsav hatására 0,5 mólos nátrium - hidroxid - oldatban forraljuk, az oldatot 5 M ecetsav-oldattal semlegesítjük, és 2, térfogat etanollal —20 °C hőmérsékleten kicsapjuk. A csapadékot HB-4 rotorban 10 percen át 0 °C-on végzett centrifugálással összegyűjtjük, és 500 pl 0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsavban oldjuk). A reakciót 4 órán át 65 'C hőmérsékleten végezzük, szűrőként 20 ml elegyet használva. A hibridizációt 103 beütés/perc Cerenkov-sugárzásű P32-jelzett próbával végezzük, nitrocellulóz szűrőként 5XSET, 0,02% Ficoll, 0,01% polivinil-pirrolidon, 0,02% marhaszétaun albumin, 0,2% nátrium - dodecil - szulfát és 50 pg/ml denaturált marha thymus dezoxi-ribonukleinsav jelenlétében. Magát a hibridizációt 36 órán át 65 °C hőmérsékleten végezzük. -Á szűrőket egyszer kloroformban, kétszer pedig 0,5% nátrium - dodecil - szulfátot tartalmazó SET-ben öblítjük, szobahőmérsékleten, majd ezt 1 órán át 60 °C hőmérsékleten, 0,5% nátrium - dodecil - szulfátot tartalmazó SET-ben megismételjük, és végül 3 mM írisz-bázisban 1 órán át szobahőmérsékleten kezelünk. A szűrőket 3 MM-papírral (Whatman) szántjuk, és X-sugárzásra érzékeny filmmel (Fuji) fényképezünk (Ilford erősítő szűrőt használva), ezt 72 órán át végezzük, —80 "C hőmérsékleten. 9 pozitív telepet látunk az autoradiogrammon, ezeket használjuk a további vizsgálatokhoz. . Mivel a transzformált sejtek primer telepei több mint egyféle rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulát tartalmazhatnak, a 9 pozitívan hibridízáló telepből izoláljuk a hibrid plazmid dezoxi-riborukleinsavat, és az előzőekben megadottak szerint eljárva E. coli HB 101 sejteket transzformálunk. A hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az alábbiak szerint izoláljuk: • Egy teleppel 10 ml triptonos táptalajt oltunk, a táptalajt ml-enként 10 pg tetraciklinnel egészítjük ki. A tenyésztést 25 ml térfogatú Erlenmeyer-Iombikokban végezzük, percenként 300-at forduló rázógépen, 15-18 órán át, 37 °C hőmérsékleten. A sejteket centrifugálással összegyűjtjük (Sorvall, HS-4 rotor, 10 perc, percenkénti 4000 fordulat, 4 °C hőmérséklet). A 0,1 g súlyú sejtmasszát 1 ml, 50 mmólos trisz-hidrogén-kloridban (pH — 8,0) szuszpendáljuk. Az oldathoz lizozim-oldatot (10 ing/ml lizozim, 50 mmólos trisz-hidrogén-kloridban (pH — 8,0) a lizozimot a Sigma cégtől vásároltuk. 10 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd 0,15 ml, 0,5 M etilén - diamin - tetraeeetsav - oldatot (pH *=■ 7,5) adagolunk. További 10 percen át inkubálunk 0 °C hőmérsékleten, majd 60 ű, 2%-os Triton X-100 (Merck) adagolunk. 30 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd percenként 15 OÜO-et forduló Sorvall SA- 500 rotorban 30 percen át 4 °C hőmérsékleten centrifugálunk. A feiülúszót 1 térfogat, TNE-vel felített fenollal proteinmentesítjük. A fázisokat Sorvall HB-4 rotorban végzett centrifugálással (10 perc, 5000 fordulat/perc, 4 °C hőmérséklet) elválasztjuk. A felső fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. Ezután 25 pg/ml végkoncentrációban ribonukleáz A-t (Sigma), 10 mg/ml TNE-ben, 10 percen át (85 °C hőmérsékleten előmelegítve) adagolunk az elegyhez, és 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, 40 percen át. Ezután 1 M nátrium-klorid és 10% polietilén-glikol 6000 (Fluka, 20 percen át 120 ”C hőmérsékleten autoklávozva) végkoncentrációt állítunk be, és 2 órán át —10 *C hőmérsékleten inkubálunk. A csapadékot Sorvail HB-4 rotorral 20 percen át, percenkénti 10 00-es fordulatszámmal, 0 °C hőmérsékleten centrifugálva összegyűjtjük, és 100 pl TNE-ben oldjuk. 1 térfogat fenollal extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot, majd 2 térfogat etanollal —80 °C hőmérsékleten 10 percen át kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A csapadékot Eppendorf-centrifugában centrifugálva összegyűjtjük, és a dezoxi-ribonukleinsavat 20 pl, 10 mM trisz-hidrogén-kloridot (pH = 7,5) és 0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó eíegyben oldjuk. 10 ml tenyészetből 8-10 pg hibrid plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. • A 9 izolált hibrid dezoxi-ribonukleinsav mindegyikével E. coli HB 101 sejteket transzformálunk, és a transzformált sejteket tetraciklint tartalmazó agarlemezekre szélesztjük, a 4. példában megadottak szerint eljárva. Mindegyik transzformációs lépésből három tetraciklínre rezisztens telepet kiemelünk, és az előzőekben megadottak szerint eljárva 10 ml tenyészetet állítunk elő, és ezekből a hibrid dezoxi-ribonukleinsavakat izoláljuk. . Az előző összes dezoxi-ribonukleinsav mintát és az újratranszformálás után kapott dezoxi-ribonukleinsavakat is Pst I endonukleázos hasítással és elektroforézissel vizsgáljuk. Az elektroforézist 1% agarózt tartalmazó gélen végezzük, 50 mM trisz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
