197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
41 197 047 42 acetát (pH ~ 7,8), és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavban. Az összes minta azonos hasítási képet ad újratranszformálás előtt és után. . Az egyik újraklónozott rekom'oináns dezoxi-ribonukleinsav molekula két csíkot mutat, az egyik a pBR 322 Pst I hasított fragmensével azonos mobilitási!, a másik mobilitása pedig 1009 bázispárból álló fragmens mobilitásának felel meg. Ezt CG- pBR 322/HLyclFN-l’b-vel jelöljük. . Egy másik rekonibináns dezoxi-ribonukleinsav három csíkra hasad; az egyik mobilitása megfelel a pBR 322 Pst 1 fragmensének, a másik 600 bázispár nagyságú fragmens mobilitásával rendlekezik, míg a harmadik 150 bázispár nagyságú. A kiónban levő rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulát CG- pBR 322/HLycIFN-ߣ-nek neveztük el. d) A CG-pBR 322/HLyclFN-ßj és a CG-pBR 322/HLycIFN-I ‘b kiónok jellemzése A fenti kiónok rekombináns dezoxi-ribonukleinsav plazmidjait az 5c) példában megadodak szerint eljárva, tenyészetből izoláljuk, és Maxam és Gilbert (41) módszere szerint a cDNS beépített szakasz nuklcotid-szekvenciáját meghatározzuk. Alapvetően az alábbiak szerint járunk el: Az izolált rekombináns plazmid dezoxí-ribonukleinsavai különböző restrikciós endonukleázokkal kezeljük. Az enzimeket az eladó (New England Biolabs) írja le, használatukat az <5 utasításai szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az enzim pufferekben zselatin helyett marhaszérum albumint használunk. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatokat TNE-vel telített fenollal proleinmentesítjük. A dezoxi-ribonukleinsavat etanoüal kicsapjuk, 50 nmiól-os trisz - hidiogén - klorid - oldatban (pH = 8,0) annyit oldunk, hogy az oldat ml-enként 50 pg dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazzon. Ezután 0,1 egység marha alkalikus íoszíatázzal inkubáljuk (Boehringer) pikomól dezoxi-ribonukleinsav 5’-végenként. Az inkubálást 37 *C hőmérsékleten végezzük, 30 percen át Az enzimet az oldat melegítésével inaktiváljuk. Ez 65 'C-on történik, 60 percen át. A dezoxi-ribonukleinsavat DEAE cellulóz kromatográfiával tisztítjuk Mueller és munkatársai szerint eljárva (47), majd etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután 5’terminállson jelöijük [gamma-P32j-ATP-vel (több mini 5000 Ci/mmól, Amersbam), majd T4 polinukleotid kinázzal (P-L Biochemicals) kezeljük Maxam és Gilbert (41) szerint eljárva, azzal, a különbséggel, hogy a kinázos reakció előtt a dezoxi-ribonukleinsavat nem denaturáljuk. A specifikus aktivitás általában 1-3x1 O'5 beütés/perc/pikomó! A jelzett dezoxi-ribonukleinsav-íragmenseket egy másik restrikciós endonukleázzal kezeljük, és a terméket 6, 8 vagy 10% poliakrilamidot tartalmazó gélen szeparáljuk, trisz - borát - etilén - diamin - tetraecetsav - pufferban. A gélről extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsav-fraginenscket, és Mueller és munkatársai szerint eljáiva (47) tisztítjuk. A nukleotid-szekvenciák meghatározására kémiailag hasítjuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekeí, és a terméket Maxam és Gilbert (41) szerint eljárva poltakril-amid gélelektroíorérissei szeparáljuk. Úgy járunk el, hogy- a CG-pBR 322/HLycIFN- l’b klón kóláit plazmid dezoxi-ribonukleinsavát az alábbiak szerint kezeljük: Egyrészről 5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Bg! II enzimmel emésztünk, 5’-terminá!isan jelzünk. és Pvu II enzimmel hasítunk. A Pvu J!-Bg! il* (a csillag a jelzett helyet mutatja), és a Bgl 11- Pvu I!" dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 6% poliakrilamidot tartlamazó gélen izoláljuk. Másrészről 5 ug plazmidut Alu I enzimmel emésztünk, 5’-íerminálLsan jelzünk, és Pst 1 enzimmel hasítunk. A Pst 1-A.lu 1* dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 8% poliakrilamidot tartalmazó gélen izoláljuk. Az egyes íragmenseket ezután Maxam és Gilbert módszere szerint hasítjuk és szekvenáljuk. A kapott nukleotid-szekvencíát a 4. ábrán adjuk meg. A cDNS beépített szakasz 5’-végét 25-35 dezoxi-guaDOzin-csoport előzi meg. A nukleotidszekvencla bzonyos mértékben hasonlít az IFN-oc (F-típus) cDNS-éhez, ahogy azt Gocddcl és munkatársai (14) és Weissmann (3) leírja. Mindamellett jó néhány változás (pontmutációk) látható, ezek közül néhány az aminosav-összeíételt is befolyásolja (lásd 4. ábra). • A CG-pBR 322/HLycIFN-ß, klonből izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavat hasonló módon kezeljük. 5 pg plazmidot Pvu II enzimmel kezelünk, és 5’-termináIison jelzünk. Az elegy felét Pst I enzimmel hasítjuk, a másik felét Bgl lí-vel. A Pst I-Pvu II* és Bgl II-Pvu !1* fragmenseket 6% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve izoláljuk, és a fentiek szerint hasítjuk. A termék nuklcotid-szekvenciáját (N-terminális-szekvencia) az 5. ábrán adjuk meg. Látható, hogy a cDNS beépített szakasz az IFN-ßj cDNS 102. számú nnkleotidjávai kezdődik, ahogy' azt Tanignchi és munkatársai (17) leírják. így a beépített cDNS képes olyan humán IFN-ß, terméket kódolni, amely N-terminális végén 11 aminosavat elvesztett. A cDNS beépített szakasz 5‘-végén 20-25 dezoxi-guanozin-csoporíot tartalmaz, és a 153. pozícióba ponírnutáciőt figyelhetünk meg. ennek követkéz inényeként egy C T-vé alakult, ez azonban a képződő aminosavat nem befolyásolja. e) A CG-pBR 322/HLycAFN-i 'b és a CG-pBR 322/HLyclFN-ß, beépített szakaszhoz kereszt-hibridizdló rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulákat tartalmazó kiónok azonosítása A fenti kiónok rekombináns plazmid dezoxi-ribonukleinsavát az 5c) példában megadottak szerint eljárva izoláljuk, tenyésztést követően. A CG-pBR 322/HLycIFN-i’b plazmid 5 ug-nyi dezoxi-ribonukleinsavát Bgl 11 enzimmel emésztjük, 5’-termí'nálisan jelezzük és Pvu II enzimmel hasítjuk. Másrészről az izolált CG-pBR 322/HLyclFN-ß, plazmid dezoxi-ribonukleinsav 5 pg-ját Pvu 11 enzim^. mel emésztjük, 5’-termináíisan jelezzük és Bg! 11 enzimmel hasítjuk. A 351 bázispárból álló Pvu IIBgi II* dezoxi-ribonuklehisav-íragmenst (A-próbs) 5 10 15 20 25 seas 4C 45 50 55 60 55 22
