197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
3 197 047 4 vagy rákos elváltozásokat több hónapon vagy éven át kezdjük, egy vagy több alkalommal naponta vagy hetente kétszer vagy többször. Mindeddig a HuIFN-a -t elégtelen mennyiségben állították elő indukált humán sejtekből, például humán lymphoblastoid sejtekből (például Burkitt lymphoma Namalwa sejtekből) vagy humán leukocitákból, amelyeket donorok friss véréből izoláltak. A HuIFN-ß forrása elsősorban a humán fibroblast volt. Leírták, hogy csak 2,6X109 nemzetközi egység nyers HuIFN-a állítható elő 800 1 tenyésztett Namalwa sejtből, és csak körülbelül 1011 nemzetközi egység nyers Hu!FN-a nyerhető évente az igen nagy vércentrumokban, például a Finn Vöröskereszt Központ Helsinkiben levő intézményében. A HulFN-a specifikus aktivitása 4X108 és 109 nemzetközi egység/mg között változik. A HulFN-a széles körű és elterjedt használatához más gyógyszerészeti készítményekkel összehasonlítva igen kevés anyagra lenne szükség. 100 g tiszta HuIFN-a 10-30 millió dózist jelent. Ezt a mennyiséget azonban elfogadható áron humán szövettenyészetből és humán Ieukocita technológiával nem lehet előállítani. A nagyméretű előállítás másik hátránya, hogy interferonok keverékét kapjuk, és a keverék elválasztása nehézkes és drága. így előnytelenné válik a tiszta, egyetlen interferon szubtípust tartalmazó készítmény használata. A fenti módszerek ipari alkalmazását limitálja továbbá az a tény, hogy a HuIFN humán sejtekből vonható ki, mégpedig olyan sejtekből, amelyek tenyészthetők (például a humán tumor sejtek és bizonyos fibroblast sejtek), vagy olyan humán sejtekből vonható ki, amelyek viszonylag nagy mennyiségben állnak rendelkezésre (például leukociták és limfociták). Ezek a módszerek azonban mind drágák és bonyolultak. Felismertük, hogy nagy mennyiségű, adott interferon típus ipari előállításának nehézségeit feloldhatjuk a molekuláris biológia fejlődő módszereivel, mivel lehetségessé vált specifikus nembakteriális eukarióta gének kifejezése baktérium sejtekben. A közelmúltban Cohen és Boyer (9) általános módszert írt le biológiailag működő dczoxi-szekvenciák replikálására. A módszer szerint kör alakú plazmid dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk, amikor lineáris dezoxi-ribonukelinsav szegmenst kapunk. Ezután ebbe az első szegmensbe egy második olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-szakaszt építünk be, amely fenotípusosan jellemző gént tartalmaz, amiután rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulát (módosított, kör alakú plazmidot) kapunk. Ezzel a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulával egysejtű mikroorganizmust transzformálunk, majd a transzformánst a nem transzformálódott mikroorganizmusokkal együtt megfelelő tenyésztési körülmények között tenyésztjük, és a szülő egysejttí mikroorganizmusok közül izoláljuk a transzformánsokat. A transzformánsok ezután termelhetik az adott proteint. Cohen és Boyer azonban nem oldotta meg interferonokat meghatározó lineáris dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia előállítását és ebből rekombináns dezoxi-ribonukleiasav izolálását. A továbbiakban ismertetjük az előzményeket. Különböző szabadalmi leírásokban és más közleményekben ismertetik a HulFN-a- és HuIFN -ßszerű aktivitással rendelkező polipeptideket meghatározó, leukocitákból és fibroblastokból származó dezoxi-ribonukleinsav-szokvenciákat, a fenti dezoxi-ribonukieinsav-szekvenciát tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat, az adott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákkal transzformált gazdasejteket, polipeptideket vagy az adott (xúipcpiidőket tartalmazó lenyészlcveket és ezeknek az előállítását. Weissmann (3), továbbá Nagata és munkatársai (10), Mantei és munkatársai (11) és Streuli és munkatársai (12) közlik a Sendai vírussal indukált humán Ieukocita kiindulási anyagot, HulFN-a-szerű aktivitással rendelkező több polipeptidet, dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat és gazdasejteket. Goeddel és munkatársai (13, 14) leírják a leukocitákból, különösen azonban a humán myeioblastoid KG-1 sejtvonalból (Sendai vírussal indukált) származó, részlegesen tisztított, 21 000 molekulatömegű HuIFN-a-szerű polipeptidet, a megfelelő dezoxi-ribonukleinsavakat és nyolc különböző humán LelFN cDNS szerkezetét. A 34307. számú európai szabadalmi közleményben (15) olyan módszert közölnek, amely alkalmas HulFN-a-szerű aktivitással rendelkező polipeptidek előállítására oly módon, hogy lymphoblastoid Namalwa sejtekből vagy humán vér leukocitákból indulnak ki Newcastle vírussal való indukciót követően, azonban konkrét adatokat vagy részleteket nem adnak meg. A 28033. számú európai szabadalmi közleményben (16), továbbá Taniguchi és munkatársai (17), Derynck és munkatársai (18) és Goeddel és munkatársai (19) közleményeiben olvashatjuk, hogy poli(l): poli(C)-vc) indukált humán fibroblastokból és különösen újszülöttek nuigzatburkáből dezoxi-ribonukleinsavak, HulFN-ß-t meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavmolekulák és az ezeket tartalmazó mikroorganizmusok állíthatók elő. A 2 063 882. számú brit (20) szabadalmi közleményben mRNS-ek, DNS-ek, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulák és HuIFN-ßj és Hu- IFN-02 molekulák termelésére képes baktérium törzsek előállításának módját adják meg génsebészettel, amelynek során kétszálú poli(I): poli(C)-ve! indukált FS11 vagy SV80 magzatburok sejtekből vagy humán fibroblastokból indulnak ki. Á 887 397. számú BE szabadalmi leírásban dezoxi-ribonukleinsavakat, rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat, az utóbbiakat tartalmazó E. coli sejteket és HulFN-ß aktivitással rendelkező polipeptideket közölnek. Az utóbbiakat humán fibroblastokból nyert inRNS-sel állítják elő, de különösen a poli(l): poli(C)-vel indukált humán magzatburkot (FS-4) használják. Általánosságban szólva, minden konkrét adat vagy részlet nélkül, a 34.3 06. számú európai szabadalmi közleményben (22) módszert írnak le a IlulFN-ß-szenJ aktivitással rendelkező polipeptid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
