197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
5 197 047 előáIirtására vonatkozóan, kiindulási anyagként poli(I): poli(C)-vel indukált humán fibroblastokat (vagy újszülöttek magzati burkát) említik. A humán lymphoblastoid interferon, a Hu- IFN(Ly) előállítható különböző mennyiségekben különböző inducerekkel stimulált Namalwa sejtekből (Johnston és munkatársai /24/). A Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekkel előállított HuiFN(Ly) 70—90% MulFN-a(Ly)-t és 10—30% HulFN-ß(Ly)-t tartalmaz. Legalább hét komponensből áll [Zoon és munkatársai (8) és Allen és munkatársai (25); lásd továbbá Havell és munkatársai (4) és Sagar és munkatársai (5)], Bár jelenleg a lymphoblastoid interferon polipeptidck teljes szerkezete ismeretlen, világossá vált, hogy a Hu- IFN-a(Ly) különbözik a HulFN-a(Le)-től. A lymphoblastoid interferon legnagyobb komponenseinél kismértékű vagy egyáltalán nem kimutatható glikozilezés történik. A különböző komponenseket eddig még nem különítették el és nem tisztították. Mivel a lymphoblastoid HulFN molekulákkal klinikai kísérletek indultak, előnyös lenne a különböző komponenseket elválasztani és terápiás hatásuk meghatározásához egyenként előállítani. Egyetlen eddig ismert rekombináns dezoxi-ribonukleinsav módszer sem vonatkozik a lymphoblastoid humán interferonok szintézisére. A találmány tárgya ennek a kérdésnek a megoldása rekombináns dezoxí-ribonukleínsav technológiával. A találmány tárgya továbbá a HuLyIFN különböző szubtípusainak szerkezetmeghatározása (aminosavszekvenciáik) és eljárás az egyes interferonok megfelelő mennyiségben való előállítására a lehető legnagyobb számú beteg kezelésére alkalmas mennyiségben. A jelen találmány szerinti eljárással megoldjuk a lymphoblastoid HuIFN-ek biológiai aktivitásához hasonló aktivitású egyes polipeptidek nagy menynyiségben is lehetséges előállítását. Az egyes polipeptidek azonosak vagy különböznek az eddig ismert FIuIFN-a (Ix) és HulFN-ß komponensektől. A találmány szerinti eljárással HuLyIFN-a vagy HuLyIFN-ß aktivitással és immunológiai hatással rendelkező polipeptideket tartalmazó készítményeket kapunk. A jelen leírásban a következő rö vidítéseket használjuk: Klón: egyetlen sejtből aszexuálisan származó sejtek tömege. Ezt a populációt genetikailag azonosnak tartjuk. Operon: olyan genetikai egység, amely szomszédos gének koordinált kifejezését operátorral és represszorral szabályozza. Kifejeződő kontroll szekvencia: olyan nukleotidszekvencia, amely működőképesen kapcsolódva strukturgénekhez kontrollálja és regulálja ezek kifejeződését, Tartalmazza a promoted és a riboszómális kötőhelyet. Promoter: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szegmens, ahol az RNS-polimeráz kötődik, és iniciálja a transzkripciót. Riboszómális kötőhely: olyan szekvencia, amely lehetővé teszi a mRNS kötődését a riboszómákhoz, és így lehetővé válik a transzláció. Expresszié (kifejeződés): a transzkripció és a transzláció folyamata. Transzkripció, bázispárosodást eredményező folyamat, amelynek során a dezoxi-ribonukieinsavban levő genetikai információ komplementer bázisszekvenciában fejeződik ki a ribonukleinsav-láncban. Transzláció: az a folyamat, amelynek során az mRNS molekulában levő genetikai információ által meghatározott specifikus aminosavak a proteinszintézis során kapcsolódnak. Nukleotid: a nukleinsavak építőkövei, purinvagy pirimidin-bázisból állnak, tartalmaznak ribózt vagy 2-dezoxi-ribózt és foszforsav-maradékot. A ribonukleotid bázisok az adenin, guanin, cítozin és uracil, ugyanakkor a dezoxi-ribonukleotid bázisok esetén az uracilt ti min helyettesíti. Vektor vagy klónozó hordozó: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, például plazmád vagy fág dezoxí-ribonukleinsav, amely egy gazdasejtben autonóm (önálló) replikációra képes, felhasználható genetikai markért tartalmaz a transzformált sejtek kimutatására, például tetraciklinnel vagy ampicillinnel szembeni rezisztenciát; a vektorhoz kísérleti úton úgy kapcsolható egy másik dezoxi-ribonukleinsav-szegmens, hogy a kapcsolt szegmens replikációja is bekövetkezik-Plazmid: extrakromoszómális, kör alakú, kétszálú dezoxí-ribonukleinsav, amely egy gazdasejtben replikációra képes. Rekombináns (hibrid) dezoxi-ribonukleínsav: különböző génekből származó szegmenseket tartalmazó dezoxi-riboiiukleinsav molekula, amely géneket az élő sejten kívül kapcsoltunk össze. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav bejut egyes gazdasejtekbe, és olt fennmarad. Nukleáz: olyan enzim, amely a nukleinsav láncok foszfcdiészter kémiai kötéseit hasítja. Ribonukleáz (RNáz): a ribonukleinsav foszfodiészter kémiai kötéseit hasító enzim. Dezoxi-ribonukleáz (DNáz): a dezoxi-ribonukleinsav foszfodiészter kémiai kötéseit hasító enzim. Restrikciós endonukleázok: a polimer láncon belül specifikus target szekvenciákon belül a polinukleotidokat hasító enzimek. A hasítást követően olyan dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket kapunk, amelyeknek „blunt” (tompa) végeik vagy „sticky” (ragadós) végeik vannak. Exonukleázok: olyan enzimek, amelyek a dezoxi-ribonukleinsavat a szálak végeitől emésztik. Lizozim: bizonyos baktériumok sejtfalában levő poliszacharidokat emésztő enzim. Reverz transzkriptáz: RNS tumor vírusok által kódolt enzim, amely RNS templátból képes komplementer egyszálú dezoxi-ribonukleinsav-szálat készíteni, és ezután ezt a dezoxi-ribonukleinsav-szálat kétszálú, csigavonal alakúvá alakítja át. DNS-polimeráz: a 3’-5’-foszfodiészter kémiai kötések létrejöttét katalizálja a dezoxi-ribonukleinsavban. DNS-ligáz: egy endonuklcáz által létrehozott egyszálú dezoxi-ribomikleinsav foszfodiészter kötésben levő hasadás helyreállítását katalizáló enzim. Poiinukleotid kináz: a dezoxi-ribonukleínsav 5’~ 5 10 15 2D 25 20 25 40 45 50 55 80 65 4
