197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
37 197 047 38 percre 42 °C hőmérsékletre melegítjük fel, és 1Ü percen át ezután 20 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 1 ml triptonos táptalajt adagolunk az elegyhez, és percenként 300-at forduló rázógépen, 30 percen át, 37 ”C hőmérsékleten tenyésztünk. A triptonos táptalaj összetétele a következő: 1% Bacto- Trypton (Difco), 0,1% élesztőkivonat (Difco), 0,1% glükóz, 0,8% nátrium-kloríd és 29,4 mg/ 100 ml kalcium-klorid-dihidrát. A táptalajt desztillált vízzel készítjük. Ezután két agar-Iemezre szélesztjük a tenyészetet, az agarlemez (Mc Conkeyagar, Difco; 0,6 ml/lemez) ml-enként 10 pg tetracíklint (Sigma) tartalmaz. A lemezeket 12-17 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. így körülbelül 5600 transzformált tetraciklinre rezisztens E. coli HB 101 telepet kapunk. 5. példa A HuIFN cDNS-t tartalmazó kiónok azonosítása a) A 13 tagú oligo-dezoxi-nukleotid primer szintézise (2. ábra) Az Itakura és munkatársai (38) és de Rooij és munkatársai (39) által ismertetett foszfo-triésztermódszerrel kémiailag olyan oligo-dezoxi-nukleotidot szintetizálunk, amely komplementer mind a HuíFN-a,-ban, mind pedig a HuIFN-ß mRNS-ben közös 13 nukleotidot tartalmazó részre. A szintézis egyes lépéseit a 2. ábrán adjuk meg. Az első sorban a kiindulási anyagokat ismertetjük (mono- és didezoxi-nukieotidok, amelyek védőcsoporíckat tartalmaznak), ezek az irodalomból Ismertek. A védőcsoportokat Itakura és munkatársai szerint hasítjuk, az 5’-monometoxi-tritil- (M) vagy' dimetoxitritil- (D) szubsztituált hidroxilcsoportok védőcsoport-hasítását 80%-cs ecetsavval végezzük, szobahőmérsékleten. Aß- ciano - etil - foszfát - csoportokat 0,1 n nátrium - hidroxid - oldattal hasítjuk dioxán és víz 4:1 arányú elegyével, szobahőmérsékleten. A felépítő egységek kondenzálását triizopropil - benzol - szulfonil - klorid, mint .aktiválószer jelenlétében végezzük, amikor a 2. ábra 7. sorában megadott 13 tagú, teljesen védett printerhez jutunk. Az utolsó lépést, az összes védőcsoport teljes hasítását az alábbiak szerint végezzük: 3 ml dioxán és 1 ml acetonitril elegyében 64,6 mg teljesen védett, 13 tagú oligo-dezoxi-nukleotid terméket oldunk, majd 200 mg szín - p - nitro - benzaldoximot és 124 mg N1, Nl, N3, N3 - tetrametil - guanidint adunk hozzá, és 27 órán át állni hagyjuk. 10 ml 25%-os ammóuium-oldatot adunk az elegyhez, és 24 órán át 50 °C hőmérsékleten tároljuk. Csökkentett nyomású térben eltávolítjuk az oldószert, a desztillációs maradékot vízben oldjuk, az oldat pH-ját ecetsavval 4-re állítjuk be, és húszszor kloroformmal extraháljuk az oldatot. A vizes oldatot elkülönítjük és csökkentett nyomású térben desztilláljuk, a desztillációs maradékot 1 ml 80%os ecetsavban oldjuk. 1 órán át állni hagyjuk az oldatot, 6 ml vízzel hígítjuk, háromszor kloroformmal extraháljuk és fagyasztva szárítjuk. A termék 1/3 részét DEAE-Sephadex A 25 gyantából készült, 10X1,3 cm méretű kromatografáló oszlopon tisztítjuk:, az eluálást 200 ml 0,2-1,2 mólos trietil - ammónium - bikarbónát - oldattal készített gradiens eluálással végezzük. A fő frakció eludlása a 0,87 móios oldatnál következik be. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálat szerint tiszta terméket tartalmazó fő frakciót háromszor vízzel desztilláljuk, 10 ml Dowex 50 W (ammónium-cik!us) gyantán át szűrjük és fagyasztva szárítjuk. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás retenciós idő (osztopnagyság: 90X0,3 cm, 60 °C hőmérséklet, 2 nú/perc; gradiens: A: 0,005 M kálium-dihidrogén-foszfát, B: 0,5 M káhum-dihidrogén-foszfát, 0,5 M káüum-klorid, pH — 4,5; 20% A------100% B, 30 perc alatt): tK 11,8 perc. b) A P32-jelzett humán IFN-a és IFN-ß specifikus cDNS-prőba előállítása (3. ábra) 40 pikomól szintetikus, 13 tagú oligo - dezoxi - nukleotid prímért (5a/ példa) és 40 pikomól (gamina-P32)-ATP-t (5700 CíXmmóE1, Amersham) keverük 100 pl alábbi összetételű elegyben: 50 mM trísz - hidrogén - klorkl (pH — 9,5), 10 mM magnézium-kloriö és 5 mM DTT. Az elegyhez 50 egység X4 polinukleotid kinázt (P-L Biochemicals) adunk, majd 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután további 20 egység enzimet adagolunk, és az inkubációt 37 ‘C hőmérsékleten 15 percen át folytatjuk. A P32-jelzetí prímért tartalmazó vizes oldatot fenolos extrakeióval tisztítjuk. A terméket tovább tisztítjuk 4 ml Sephadex G-50 gyantából készült oszlopon, 1 mM írisz - hidrogén - kloriddal (pH =** 8,0). 0,1 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az egyes frakciók radioaktivitását a Cerenkov-sugárzás meghatározásával mérjük. Pikoniólnyi mennyiségű oligo - dezoxi - nuklcotidra nézve 4xlü6 Cerenkov-beütés/perc specifikus aktivitást kapunk. 40 pikomól P33-jelzett prímért fagyasztva szárítunk, 91 pl, 14 pg po!i-(A)-ribonukleinsavat (ezt az első példában megadottak szerint Namalwa sejtekből kapjuk) tartalmazó vízben szuszpendáljuk, és 60 másodpercen át 100 "C hómérsékleten tartjuk. Az elegyhez 9 pl 4 mólos kálium-kloridot adunk, és 60 percen át 25 °C hőmérsékleten inkubálunk. Ezután 450 pl reverz transzkriptáz enzimet adunk úgy, hogy a reakcióelegy 40 mM trisz-bidrogén-kloridot (pH •» 8), 4 mM magnézium-kloridot, 1 mM DTT-t (P-L Biochemicals) és 90 egység madár myeloblastosis vírus AMV) reverz transzkriptázt tartalmazzon. 1 órán át 37 “C hőmérsékleten inkubálunk. Az oldatot 1 térfogat, TNE-oldattai telített fenollal extraháljuk, és a nukleinsavakat 2 térfogatnyi etanollal csapjuk ki, —20 °C hőmérsékleten, 10 órán át tárolva. A csapadékot centrifugálissal (HB-4 rotor, 20 perc, 10 000 fordulat/perc, 0 °C hőmérséklet) összegyűjtjük, és *20 pl alábbi összetételű elegyben oldjuk: 90% formamid (Merck, analitikai tisztaságú), 1 mM etiléndiamin-tetraecetsav, 0,05% bróm-fenol kék és 0,05% xiiol-cián kék. A mintát 2 percen át 90 *C hőmérsékleten tartjuk, és trisz - borát - etilén - diamin - tetraecetsawal készült, 5%-c,s poliakrilamid 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 20
